[发明专利]肝癌相关microRNA检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种肝癌相关microRNA检测试剂盒，包括有：针对每种待检测的肝癌癌相关microRNA有至少一条一级信号放大探针、至少一条二级信号放大探针、和至少一条三级信号放大探针，以及捕获探针，所述肝癌相关microRNA的捕获探针的P1序列选自SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.12。本发明所选择的捕获探针和信号放大探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种肝癌相关microRNA检测试剂盒。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex,RISC)，通过碱基互补配对的方式识别靶miRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶miRNA或者阻遏靶miRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。

肝细胞肝癌(HCC)是我过常见的恶性肿瘤，其发生发展是多因素、多基因和多步骤的复杂过程。新近研究结果表明，多种miRNA通过调节其靶基因参与HCC的细胞生物程序调控，间接发挥癌基因和抑癌基因的功能。研究发现，与临近肺肿瘤组织相比，77.8％的肝癌组织中miR-138表达下调。肝癌组织中过度表达的miR-138可诱导细胞周期阻滞，阻止细胞集落形成，降低肿瘤细胞的细胞存活率。此外还有研究表明，提高miR-122的表达水平可抑制肝癌细胞生长；miR-26a在肝癌细胞中呈现表达下降，降低磷酸化的PRB，阻止细胞从G1期向S期的过度；miR-101上调可使肝癌G0/G1期细胞明显增多，S期细胞减少，进一步实验研究表明，其通过抑制EZH2基因表达，对人肝癌细胞增殖活性具有负调控作用；以及mir-21在肝癌转移和侵犯的作用和基本作用机制得到明确。

目前，针对miRNA的检测方法主要有Northern Blot、基因芯片、荧光定量探针法、基于微球的流式细胞术技术。但NorthernBlot方法敏感度低、耗时长且RNA的用量较大，不适合高通量分析；基因芯片技术能实现miRNA的高通量分析，即在一块芯片上同时检测多个miRNA，但缺点是结果准确性低，重复性差，实验价格昂贵；荧光定量探针法检测灵敏度高，但检测费用昂贵；而基于微球的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中，更有利于捕获miRNA序列，因此提高了准确性，但是由于miRNA同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。

原位杂交技术是一种定位和形态学检测保存的组织切片或细胞制备物中特异性miRNA序列的方法。然而目前现有技术中对miRNA的多重平行检测仍存在许多困难。首先，需要分别制备各靶miRNA的标记探针；其次，难以同时原位检测多种靶miRNA的表达。因此，目前报道的对多种miRNA的检测只能用不同的标记方法，然而，用不同的标记方法不能很好地控制探针与细胞中非特异性序列可能的交叉杂交。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的肝癌相关microRNA检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。