[发明专利]传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

传染性造血器官坏死病（Infectioushaematopoieticnecrosis，IHN）是OIE规定需要通告的3种弹状病毒(rhabdovirus)性疾病之一。IHN最初流行于北美西部地区，主要存在于溯河产卵的鲑鱼群中。上世纪70年代，传染性造血器官坏死病毒（IHNV）感染成为了美国人工养殖的虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)的重要病原。接着IHN随着污染了病毒的鱼卵传到了西欧以及东亚的不少国家。虹鳟在这些国家是一种引进品种，IHN对虹鳟养殖造成了严重的经济损失。同弹状病毒（Rhabdoviridae）科粒弹状病毒（Novirhabdovirus）属的其他成员相似的是，IHNV为单负股RNA病毒，病毒基因组由11000个核苷酸组成，编码6个蛋白，病毒粒子呈子弹状。遗传进化分析显示，北美地区分离到的IHNV毒株的基因变异程度较低。而在欧洲、日本以及韩国的虹鳟中分离到的IHNV毒株的差异却较大，这显示出病毒在引入上述几个地区之后是各自独立遗传进化的。IHNV出现的基因变化被认为同宿主特异性和毒力的改变有关。传染性造血器官坏死病（IHNV）最初在造血组织内增殖，其后侵袭到其他内脏器官。经解剖可观察到，鱼的鳃丝褪色呈苍白色，显著贫血，肝、脾、肾也褪色，贫血。病鱼初期呈昏睡状，游动迟缓，有时沉底；随水流漂浮在水面上的病鱼体色发黑，眼球突出，腹部膨大，鳍基充血，不透明，粘液状管型粪便悬挂于肛门，体侧肌肉组织如背鳍区和一些鳍基部的骨胳肌中有“V”形出血斑块的症状。

培养分离传染性造血器官坏死病毒一般需要15天以上才能得出结果，检测周期太长，不适应口岸快速检测和大通关的时代要求。

因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。

利用恒温扩增技术原理研究开发的IHNV检测方法与检测试剂盒能快速、准确地检测传染性造血器官坏死病（IHNV），便于在基层水产养殖站受实验条件限制，无法承受昂贵的仪器费用环境下，为鱼类的传染性造血器官坏死病进行诊断、确诊提供依据，以便及时采取相应措施，防止大面积传播。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种传染性造血器官坏死病毒的RT-LAMP检测引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种传染性造血器官坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供传染性造血器官坏死病毒的RT-LAMP检测方法。

本发明所采用的技术方案如下：

一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

IHNV-F3：CTATCTAGACGAACTGGTGAAG（SEQIDNO:1）；

IHNV-B3：GTGAAGTTGGTAGCGTGAT（SEQIDNO:2）；

IHNV-FIP：ATGCGGAGATCGGAACTTGGGCACGCCGAGATAATATCAA（SEQIDNO:3）；

IHNV-BIP：TCTACGCTATGCACAAAGGCTCTCCTGTCCTTGGATACCTC（SEQIDNO:4）；

IHNV-LF：ATAGGAGGTATGGAGTCACACT（SEQIDNO:5）；

IHNV-LB：CATGACGGTCGTTGTGGA（SEQIDNO:6）。

一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其包括权利要求1所述的检测引物组。

一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，包括以下成分：（1）权利要求1所述的引物组；（2）逆转录酶；（3）DNA聚合酶；（4）RT-LAMP反应液；（5）阳性对照和阴性对照。

上述检测试剂盒，其引物组中外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1：8：4。

上述检测试剂盒，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；所述逆转录酶为AMV逆转录酶。

上述检测试剂盒，所述RT-LAMP反应液含有：10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2。