[发明专利]传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

IHNV-F3：CTATCTAGACGAACTGGTGAAG（SEQIDNO:1）；

IHNV-B3：GTGAAGTTGGTAGCGTGAT（SEQIDNO:2）；

IHNV-FIP：ATGCGGAGATCGGAACTTGGGCACGCCGAGATAATATCAA（SEQIDNO:3）；

IHNV-BIP：TCTACGCTATGCACAAAGGCTCTCCTGTCCTTGGATACCTC（SEQIDNO:4）；

IHNV-LF：ATAGGAGGTATGGAGTCACACT（SEQIDNO:5）；

IHNV-LB：CATGACGGTCGTTGTGGA（SEQIDNO:6）。

2.一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组。

3.根据权利要求2所述的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：（1）权利要求1所述的引物组；（2）逆转录酶；（3）DNA聚合酶；（4）RT-LAMP反应液；（5）阳性对照和阴性对照。

4.根据权利要求3所述的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1：8：4。

5.根据权利要求3所述的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶；所述逆转录酶为AMV逆转录酶。

6.根据权利要求3所述的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述RT-LAMP反应液含有：10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2。

7.根据权利要求3所述的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：阳性对照为含有传染性造血器官坏死病毒（IHNV）囊膜糖蛋白基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC水。

8.利用权利要求2～7任一项所述的试剂盒检测传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的方法，包括如下步骤：

（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA；

（2）恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：IHNV-F30.2μM，IHNV-B30.2μM，IHNV-FIP1.6μM，IHNV-BIP1.6μM，IHNV-LF0.8μM，IHNV-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA1~100ng，用DEPC水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应60～90min，并在80℃持续2min；

（3）结果判断：通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。

9.根据权利要求3所述的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：还含有显色剂SYBRGreenI。

10.利用权利要求9所述的试剂盒检测传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的方法，包括如下步骤：

（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取纯化样品RNA；

（2）恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：IHNV-F30.2μM，IHNV-B30.2μM，IHNV-FIP1.6μM，IHNV-BIP1.6μM，IHNV-LF0.8μM，IHNV-LB0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待检RNA1~100ng，用DEPC水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应60～90min，并在80℃持续2min；

（3）结果判断：将上述反应管中置于ESE-QuantTubeScanner中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。