[发明专利]一种脱细胞生物羊膜及种以及京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及脱细胞生物羊膜和京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法。

背景技术

羊膜是胎膜的最内层，属于生物膜中的一种，是一类天然细胞外基质类生物衍生材料。羊膜由滋养细胞层分化而来，表面光滑，半透明，有韧性及弹性，厚度为0.02-0.50mm，主要由I、III型纤维胶原蛋白构成，含有少量的VI、V型胶原，其中含有多种生长因子，如成纤维细胞生长因子-2(fibroblastgrowthfactor-2,FGF-2)、转移生长因子-β(transforminggrowth-β，TGF-β)、促进血管生成的血管内皮生长因子(VEGF)，还含有纤维连接蛋白(fibronectin,FN)等。羊膜不表达HLA-A、B、C及DR抗原或β2微球蛋白，透明且无血管、淋巴和神经组织，其抗原性远低于普通组织。大量研究表明，羊膜具有良好的细胞相容性和组织相容性，并具有部位特异的组织再生能力，为一新型的生物衍生材料。

羊膜作为生物材料应用于基础及临床已经有多年的历史。早在20世纪初期就有用含羊膜的胎膜供体移植于烧伤和溃疡创面的报道，随后在颅脑外科、腹腔外科、妇产科及眼科均有其应用的报道。具体来说其主要用途有：①用于眼睛表面疾病如角膜修复、先天性青光眼、角膜溃疡等；②用于修补鼓膜损伤；③用于外科手术后预防粘连；④用于烧伤后表面覆盖等。

然而，羊膜存在细胞残留、机械性能不足以及降解周期较短等缺陷，限制了其临床应用范围。根据临床报道，由于羊膜细胞的存在，在眼科，羊膜植片可能会发生植片排斥反应、植片脱落、移位溶解、感染等并发症，其安全性存在一定的风险。此外，羊膜较薄，抗拉强度不足，抗张力强度弱，降解时间较快等，不能用于需要承受一定力学负荷的组织缺损的修复，如各种类型的胸壁、腹壁缺损(外伤性缺损、先天性缺损、医源性缺损等)；管道器官部分缺损(尿道、膀胱、输尿管、食管、胆管、肠穿孔、血管等)；周围神经缺损；韧带缺损等。因此，有必要对羊膜进行脱细胞处理，以降低其免疫原性，同时，采用适当的方法对羊膜进行改性处理，既能改善去抗酶解性能，增强其机械性能，又能保持其生物活性，以满足更多的临床需求。

现在对生物源材料常用的改性措施有化学法，物理法等。化学法改性常用戍二醛、碳化二亚胺、顺丁稀二酸酐等，其残留物均有一定组织毒性，为尽可能减少其残留量，必然会增加生产成本，不是最好选择。物理法主要采用紫外光、射线、微波等，虽然无毒无害，但生产过程中难以控制其时间及强度，难以控制其改性质量。近几年新出现的化学交联剂京尼平(Genipin，CASNO:6902-77-8)，是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然生物交联剂，可对生物源材料如胶原、壳聚糖、玻璃酸钠、蛋白、明胶等进行改性处理，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂。而能提高拉伸强度，增强其生物活性，有利于组织再生愈合，生物相容性改善。

王岚等，“京尼平交联羊膜的制备及其体外性能研究”，第三军医大学学报2012年2月28日第34卷第4期报道了一种用京尼平交联羊膜的方法，该方法可以在一定程度上提高其抗酶解性能和力学性能，但是提高程度有限，其在第2周的降解率为34.93％，在第4周降解率就高达74.62％。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法。

本发明京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法，包括如下步骤：

a、制备脱细胞生物羊膜：

(1)取羊膜，用甲醇-氯仿混合溶液浸泡22～24h，所述混合溶液中甲醇与氯仿的体积比为1:1～1:3，纯化水或去离子水清洗；

(2)用0.5～1％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液浸泡22～24h，纯化水或去离子水清洗；

(3)用0.25～0.5％(w/v)胰蛋白酶溶液消化22～24h，纯化水或去离子水清洗。

b、取步骤a制备的脱细胞生物羊膜，浸泡于浓度为0.2％～1％的京尼平溶液中，35～40℃恒温下作用0.5～72h，纯化水或去离子水清洗；

c、病毒灭活，纯化水或去离子水清洗，真空冷冻干燥，即可。

步骤(1)中，所述混合溶液中甲醇和氯仿的体积比为1:1；所述浸泡的时间为24h。

步骤(2)中，所述十二烷基硫酸钠溶液的浓度为0.5％(w/v)；所述浸泡的时间为24h。

步骤(3)中，所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.25％(w/v)；所述消化时间为24h。

步骤(1)、(2)和(3)中，纯化水和去离子水清洗的次数为3次。