[发明专利]一种藻酸盐组成的微胶囊中合成胞外蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种由聚乙烯亚胺涂覆藻酸盐组成的半透微胶囊中合成胞外蛋白质的方法。

背景技术

从分子水平上了解蛋白质的功能是研究生物基因的关键，如今随着生物技术的发展，对蛋白质表达纯化技术的要求越来越高，但目前传统应用的细胞重组蛋白质体系因其自身的局限与不足无法使研究达到理想状态，于是无细胞蛋白质系统应运而生并得到快速发展。

无细胞蛋白质合成系统是一种以mRNA或DNA为模板，通过在细胞抽提物的酶系中补充底物和能源物质来合成蛋白质的体外系统。这一蛋白质合成系统能够在没有活体细胞存在的情况下进行连续的转录和翻译来合成目标蛋白质。与传统的体内重组表达系统相比，体外无细胞合成系统有其特殊的优势：1、大部分的能量和胞内资源用于合成目标蛋白质；2、蛋白质合成的条件相对易控，可方便加入所需底物和催化剂，促进蛋白的表达和折叠；3、用于表达有毒的蛋白质，避免毒性蛋白对宿主细胞的致死作用；4、能在多孔板（如96孔板）上同时平行合成多种蛋白质，满足高通量药物筛选和蛋白质组学研究的需求；5、能直接以PCR产物作为模板合成蛋白质，可进行突变蛋白的快速筛选，实现蛋白分子的体外定向进化；6、反应体系灵活，可以与其它生物技术相偶联，目的蛋白纯化方便，有利于后续步骤的开展研究。

无细胞蛋白质合成系统应用于（1）结构蛋白质组学；（2）高通量筛选和功能蛋白质组学；（3）蛋白质进化；（4）对蛋白质进行特殊标记；（5）蛋白质合成的微小化，无细胞蛋白质合成系统甚至可以达到纳升的尺度，这是体内蛋白质合成无法想象的水平。但是无细胞系统不能进行共翻译和翻译后糖基化修饰，也不能进行其它真核蛋白的复杂修饰。无细胞蛋白合成系统试剂盒虽然使用方便，但是价格昂贵而且体系中的能量和底物都需要不断地再生，目前还无法推广到工业化生产。因此需要进一步的研究以降低成本。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种藻酸盐组成的微胶囊中合成胞外蛋白质的方法，以完善现有技术中存在的不足。

为此，采用如下的技术方案，一种藻酸盐组成的微胶囊中合成胞外蛋白质的方法，其特征在于采取以下步骤：

A)在微流体装置中分别注入外层水相、油相和内层水相，流速分别为0.01-0.05,0.1-0.3和4-5mol/L；所述外层水相是含1.0wt%十二烷基甜菜碱的超纯水，所述内层水相是含1.0wt%海藻酸钠的超纯水、0.6wt%的氯化钠和0.1wt%的荧光素葡聚糖的混合液；

B)调节内层水相的渗透压至200-500，在微管道的节点处形成水包油包水液滴；

C)在载玻片上将步骤B)得到的水包油包水乳化液与包含0.05-0.5mol/L氯化钙和0.05-0.5wt%聚乙烯亚胺的交联溶液接触，通过交联反应形成带聚离子复合膜的海藻酸钙小珠；

D)用大肠杆菌试剂盒中的酶和底物合成胞外蛋白质，以试剂盒中的绿色荧光蛋白的DNA编码为模板，DNA浓度为0.07-2ng/μL；

E)将模板DNA、转录酶和翻译酶及底物加入步骤A)中的内层水相，依次进行上述步骤A、B、C，得到半渗透微胶囊；

F)通过离心收集步骤E)得到的半渗透微胶囊，将含有底物的水相加入微胶囊悬浮液中，将微胶囊悬浮液置于培养皿中，在20-50℃下培养2-10小时使蛋白质合成，然后在5-10℃下培养12-24小时使蛋白质充分形成。

通过以上制备方法，本发明的有益效果是：（1）微胶囊由水包油包水微滴通过破裂诱导封装方法制备，可减少被封装材料的渗漏，并且制得的微胶囊有统一的粒径分布；（2）用绿色荧光蛋白编码的模板DNA水溶液和合成胞外蛋白质所需的酶由微流体装置等分入水包油微滴，微滴转化为半渗透微胶囊，通过检测微胶囊中合成的绿色荧光蛋白质中的荧光确认胞外蛋白质的合成；(3)由聚乙烯亚胺涂覆的藻酸盐组成的半透聚离子络合物膜可使合成蛋白质的底物顺利扩散到微胶囊中，底物和副产物通过膜持续交换可使蛋白质持续合成；（4）尽管由于微胶囊的体积小使得合成的蛋白质产物很少，但小分子副产物可透过半渗透膜分泌出去，蛋白质仍保留在微胶囊中。

具体实施方式

实施例1采取以下步骤：

A)在微流体装置中分别注入外层水相、油相和内层水相，流速分别为0.01,0.1和4mol/L；所述外层水相是含1.0wt%十二烷基甜菜碱的超纯水，所述内层水相是含1.0wt%海藻酸钠的超纯水、0.6wt%的氯化钠和0.1wt%的荧光素葡聚糖的混合液；

B)调节内层水相的渗透压至200，在微管道的节点处形成水包油包水液滴；