[发明专利]一种用于检测PRRSV欧洲株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征技术领域，具体说是一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征欧洲株病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)自二十世纪八十年代末期开始流行，1992年国际兽医局正式命名，主要感染猪，尤其是母猪，该病严重影响其生殖功能，临床主要特征为流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难，仔猪死亡率高、感染猪出现免疫抑制等现象，因在发病过程中出现短暂性的两耳皮肤紫绀，故又称为蓝耳病。

最早关于PRRSV起源的假说是PeterG.W、经过大量的实验研究后提出的，他认为PRRSV可能起源于LDV(鼠乳酸脱氢酶病毒)，LDV通过口服或伤口途径野家鼠传播至欧亚野猪，在野猪体内逐渐生存下来并进行繁殖变成适应性宿主。随着美国引进野猪最先将病毒传播至北卡罗来纳州并生存下来，从此病毒就在欧洲和北美进行各自独立的变异、进化。经过约70年变异、进化，并从野猪群传到了家猪群，也形成了目前的美洲型和欧洲型。与所有的RNA病毒一样，PRRSV具有高度的变异性，易形成一个异源的种群，因其基因序列及抗原性的差异，目前PRRSV被分为欧洲株和美洲株。

目前，国内外就PRRSV的检测方法而言，已有复合式RT-PCR方法，普通RT-PCR方法，荧光定量RT-PCR方法，但是上述方法都是通用型的，只能检测是否PRRSV感染，无法区分哪种毒株感染引起，国内也没有针对欧洲株的检测方法，国外检测试剂检测一份样品的价格往往是几十元甚至上百元人民币，成本过高使业主无法接受。所以导致接种疫苗存在很大盲目性，进而导致人们预防和监测PRRS的难度加大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服目前国内市面缺乏用于检测欧洲株PRRSV的技术手段的难题，提供一种能够快速、敏感、准确以及低成本的用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法，本试剂盒及使用方法还适用于检测低微含量的猪繁殖与呼吸综合征欧洲株病毒。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征欧洲株病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，包括OneStepRT-PCRbuffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物及SEQIDNO:3的探针引物的混合物。

所述序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2引物混合物的包括：

SEQIDNO:1：上游引物AGGAAGAACCGAGCTAGTGACAAT；

SEQIDNO:2：下游引物CATAAGGCGCTGGCTGATAGACC。

探针引物序列为：

SEQIDNO:3：GCCGGCCTGAAGCAACTGGTGG。

所述探针引物的5’端标记物为FAM报告荧光基团、3’端标记物为TAMRA淬灭荧光基团。

SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的由5’端向3’端延长的序列：

SEQIDNO:4(273bp)：

aggaagaaccgagctagtgacaatgccggcctgaagcaactggtggcacagtgggataggaaattgagtgtgaccccccccccaaaaccggttgggccagtgcttgaccagatcgtccctccgcctacggatatccagcaagaagatgtcaccccctccgatgggccaccccatgcgccggattttcctagtcgagtgagcacgggcgggagttggaaaggccttatgctttccggcacccgtctcgcggggtctatcagccagcgccttatg。

所述阴性对照为无RNA/DNA酶水。

所述阳性对照为含有PRRSV欧洲株基因序列的阳性质粒pGM-273，其构建方式如下：