[发明专利]一种用于检测PRRSV欧洲株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种用于检测PRRSV欧洲株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，包括OneStepRT-PCRbuffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的引物及SEQIDNO:3的探针引物的混合物，其特征在于：所述序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的引物序列为：

SEQIDNO:1：上游引物AGGAAGAACCGAGCTAGTGACAAT；

SEQIDNO:2：下游引物CATAAGGCGCTGGCTGATAGACC。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测PRRSV欧洲株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，其特征在于所述探针引物序列为：

SEQIDNO:3：GCCGGCCTGAAGCAACTGGTGG。

3.根据权利要求1所述的PRRSV欧洲株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，其特征在于所述探针引物混合物扩增出的条带序列为：

SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的由5’端向3’端延长的序列：

SEQIDNO:4：

aggaagaaccgagctagtgacaatgccggcctgaagcaactggtggcacagtgggataggaaattgagtgtgaccccccccccaaaaccggttgggccagtgcttgaccagatcgtccctccgcctacggatatccagcaagaagatgtcaccccctccgatgggccaccccatgcgccggattttcctagtcgagtgagcacgggcgggagttggaaaggccttatgctttccggcacc

cgtctcgcggggtctatcagccagcgccttatg。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种用于检测PRRSV欧洲株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，其特征在于所述扩增引物及探针引物SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3的引物浓度均为10pmol/μL，引物体积配比为1:1:1。

5.根据权利要求1所述的一种用于检测PRRSV欧洲株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，其特征在于所述阳性对照为构建的pGM-273阳性质粒以及利用其倍比稀释后制作为标准曲线。

6.一种如权利要求1所述检测PRRSV欧洲株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

a．使用权利要求1所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增，条件如下：42℃反转录5min；94℃预变性2min；94℃20s，退火温度52℃30s，72℃20s，40个循环；

b.结果分析

根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测；再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性；也可以依扩增得到的Ct值根据标准曲线对样品进行准确定量。

7.根据权利要求6所述检测PRRSV欧洲株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒的使用方法，其特征在于所述使用试剂盒中的试剂制备荧光定量RT-PCR的反应体系为：

a.OneStepRT-PCRbuffer：12.5份；

b.引物混合液3份；

c.酶混合物1份；

d.无RNA/DNA酶水5.5份；

e.提取样品的RNA模板3份；

f.阳性对照pGM-273阳性质粒3份；

g.阴性对照无RNA/DNA酶水3份。

8.根据权利要求7所述检测PRRSV欧洲株的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒的使用方法，其特征在于所述反应体系中的引物混合液3份为引物浓度为10pmol/μl的三条引物混合液，其中273bp上游引物1份，273bp下游引物1份，探针引物1份。