[发明专利]一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法

说明书

技术领域

本发明属细胞生物学领域，具体涉及一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法。

背景技术

干细胞(StemCells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括胎盘、脐带、脐带血与骨髓等。

蜕膜间充质干细胞(Decidua-derivedmesenchymalstemcells，DMSCs)除了具有间充质干细胞一般表型及分化潜能外,还具有低免疫原性等独特性质,是一种多能基质细胞。蜕膜间充质干细胞不但为妊娠期间胚胎植入提供适宜环境,而且通过表达免疫调控因子与多种免疫细胞相互作用,如T细胞、NK细胞及DC等,发挥其在胚胎植入、免疫耐受建立及正常妊娠维持中的重要作用。目前蜕膜间充质干细胞已经应用于再生治疗,具有较高的临床应用价值。

蜕膜间充质干细胞(DMSC)与人脐带间质干细胞UCMSC相比，都来源于废弃组织，取材方便、不对人体造成伤害、不涉及伦理道德问题，且免疫原性低、具有免疫抑制性，可以抑制其他细胞引起的免疫反应，减缓移植物抗宿主病，分泌多种细胞因子，抑制炎症反应、细胞凋亡，具有造血支持作用，表达间充干细胞标记。但DMSC具有更强的跨系分化能力，能分化成外、中、内胚层细胞，表达部分胚胎干细胞标记(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、COT4、REX-1、TRA-1-61)，有人称DMSC为亚全能干细胞，其发育阶段上与胚胎干细胞接近。相对于骨髓间充质干细胞(BMMSC)，DMSC增殖迅速、更强的长期增殖能力、多系分化能力更佳。并且，DMSC可以和UCMSC一样进行深低温保存，可用于建立细胞库，而骨髓来源MSC却很难实现。

胎盘壁脱膜中含有丰富的间充质干细胞，易于体外分离培养，细胞数量更多，体外可大量扩增，缩短细胞培养的时间，取材方便，且具有多向分化潜能，因而具有更大的临床应用价值，是细胞移植治疗和组织工程学的良好来源。

壁蜕膜作为母胎组成部分之一，跟其他间充质干细胞一样，符合2006年国际干细胞协会发表的间充质干细胞的特性。贴壁生长，流式指标合格，具有成骨、成脂、成软骨的能力。此外壁脱膜细胞还能产生某些免疫抑制因子而使其具有免疫抑制效应，不但为妊娠期间胚胎植入提供适宜环境，而且通过表达免疫调控因子与多种免疫细胞相互作用，从而对胎儿成长发育免疫受排斥起着至关重要的作用。

目前常规培养间充质干细胞多用动物血清，如鸡、猪、牛等，其中胎牛血清因获取量大、污染轻而被广泛应用。但近年随着人畜共患病发病率的增加，以异种血清培养的组织向临床应用的安全性受到质疑，因此自体血清培养越来越受到重视。

但目前公开的各类胎盘间充质干细胞制备方法虽均能获得间充质干细胞，但都不一定为母源性，也不符合临床应用的标准，本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现胎盘源壁蜕膜间充质干细胞的临床标准产品。

发明内容

针对现有技术缺陷，本发明提供一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，本发明制备方法在胎盘采集前对产妇进行筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿者作为采集目标，且采集男婴胎盘，之后进行分离扩增进行规模化培养直至第三代，进行冷冻保存，对分离过程及冷冻过程的的中间品进行一系列质量检测，冷冻后细胞复苏洗涤待用，活率无明显降低。

本发明提供一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，所述制备方法为：

A、壁蜕膜分离：将分离获得的胎盘用生理盐水清洗后，剥离壁蜕膜，并将撕下的壁蜕膜剪成小块置于离心管中；

B、使用胶原酶对离心管中的壁蜕膜进行消化；

C、间充质干细胞原代培养：将消化后的壁蜕膜进行过滤，洗涤后得间充质干细胞，将间充质干细胞在完全培养基中培养；细胞密度达约8000-9000个/cm²，此后每3天换液一次，至细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；

D、间充质干细胞传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为8000-9000个/cm²；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，收集细胞并计数和活率，按2×10⁷/ml/管进行冷冻保存；