[发明专利]一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法

权利要求书

1.一种胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：

A、壁蜕膜分离：将分离获得的胎盘用生理盐水清洗后，剥离壁蜕膜，并将撕下的壁蜕膜剪成小块；

B、使用胶原酶对壁蜕膜进行消化；

C、间充质干细胞原代培养：将消化后的壁蜕膜进行过滤，洗涤后得间充质干细胞，将间充质干细胞在完全培养基中培养；细胞密度达约8000-9000个/cm²，此后每3天换液一次，至细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；

D、间充质干细胞传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为8000-9000个/cm²；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，收集细胞并计数和活率，进行冷冻保存；

E、胎盘源壁蜕膜间充质干细胞使用：取出冷冻细胞，复苏，复苏后洗涤，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和人白蛋白溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。

2.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述胎盘为经过筛选、采集的健康足月男婴胎盘，分离获得的胎盘需置于胎盘保存盒中4℃冷藏，并于24小时内进行处理。

3.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，将撕下的壁蜕膜剪成1～4mm³的小块。

4.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，使用浓度为2mg/ml的Ⅱ型胶原酶对壁蜕膜进行消化，消化温度37℃，消化1小时，恒温振荡。

5.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述步骤C中，采用输血器滤网进行过滤，所述在完全培养基中培养的条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度环境，所述胰蛋白酶的浓度为0.125％，由0.25％成品胰酶稀释1倍制成。

6.根据权利要求5所述的临床级胎盘源壁蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述输血器滤网孔径≤170nm；所述完全培养基由基础培养基和血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例为10％，谷氨酰胺比例0.02mmol/ml。

7.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述步骤D中，对收集的细胞统计细胞数和细胞活率，并对细胞上清进行无菌检测、支原体检测；以及对间充质干细胞进行表面标志、分化检测。

8.如权利要求7所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述对间充质干细胞进行表面标志、分化检测具体为：按照间充质干细胞标准检测阳性指标以及阴性指标；对第三代间充质干细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定。

9.如权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞分离冷冻的制备方法，其特征在于，所述步骤E中，复苏条件为40℃，2min；复苏后用生理盐水300g，洗涤两次每次10min。

10.根据权利要求1所述的胎盘源壁蜕膜间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤D中，所述冷冻保存所用细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度10％。