[发明专利]一种分泌型Sema4C蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，尤其涉及一种新发现的分泌型Sema4C蛋白及其应用，具体地为一种可用于乳腺癌早期检测及术后监测的以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的ELISA(酶联免疫吸附测定法)试剂盒的制备及应用。

背景技术

乳腺癌发病率居女性患者第一位，约占女性所患全部恶性肿瘤的23％。据国家卫计委资料显示，2004-2005年，中国女性乳腺癌的死亡率为5.9/10万，居恶性肿瘤死亡率的第6位。近15年间，我国乳腺癌发病和死亡的年龄调整率及绝对死亡人数均明显上升，是近年来恶性肿瘤增长幅度最大的肿瘤，且呈年轻化趋势。面对如此严峻的形式，国家卫计委及时开展两癌筛查以期早期发现乳腺癌，在一定程度上明显降低了局部晚期乳腺癌(LABC)的发病率，使乳腺癌患者病死率明显降低。但乳腺癌患者术后随访时间长，除影像学外尚无明确的肿瘤标记物，严重影响了乳腺癌患者的术后监测，导致不易发现的肿瘤局部复发和转移，是乳腺癌患者的重要死因。因此，临床上迫切需要发现乳腺癌新的血清学肿瘤标志物用于乳腺癌的无创性早期诊断、术后评价治疗效果和随访监测，以期早期发现乳腺癌的复发和转移。

肿瘤标志物的价值表现在其敏感性和特异性上。理想的肿瘤标志物应该是敏感性高，特异性强，表达量或血清中水平与肿瘤组织扩散或肿块大小成正相关。临床上目前尚无乳腺癌特异的肿瘤标志物检测，常常使用肿瘤标志物CEA、CA153用于乳腺癌患者的检测。由于CEA的多克隆抗体容易与样品中无关抗原结合，造成假阳性结果增多。肿瘤标志物CA153也存在着同样的问题，特异性不高。因此，寻找一种兼顾敏感性和特异性的血清学肿瘤标志物，应用于乳腺癌的临床检测，以期达到乳腺癌早期诊断、术后监测及预后评估的目的是乳腺癌诊治中迫切需要解决的课题。

ELISA技术自本世纪70年代出现开始，就因其高度的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点，在临床和生物疾病的诊断与控制等领域倍受重视，成为检验中最为广泛应用的方法之一。特别是随着蛋白质分离纯化技术和基因工程技术的不断发展，各种高纯度抗体、抗原和抗体复合物得以制备，以及单克隆抗体技术的应用，使得该诊断检测技术在特异性、灵敏度和客观性等方面都有了大幅度的提高，并且在自动化免疫技术的推进之下进一步具有了精确的定量分析能力。由于ELISA的技术条件要求低、携带方便、常以试剂盒的形式出现且易商品化、操作简便和经济实惠，已成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术。

膜型Sema4C蛋白(Semaphorin4C)是一个由833个氨基酸组成的分子量约为93.5KDa的酸性蛋白质，属于脑信号蛋白家族，最初是在神经系统研究中而得，对它的深入研究发现，在健康成人体内膜型Sema4C蛋白表达极微弱，但在各类癌症患者包括乳腺癌、宫颈癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌和卵巢癌等多种病变组织中可检测到显著高表达。

但是，膜型Sema4C蛋白在应用中存在诸多缺陷，例如，膜型Sema4C蛋白不能通过Elisa检测，必须利用免疫组化技术，免疫组化技术的前提必须把肿瘤组织切除下来后检测，用于肿瘤转移和术后复发监测极不方便，而分泌型Sema4C蛋白可以很好的克服上述缺陷。

SEMA4C基因是发明人早期通过激光捕获、显微切割(LCM)技术从乳腺癌患者及良性乳腺肿瘤患者中切取人淋巴管内皮细胞，微量RNA提取后经无偏性线性扩增，最后进行表达谱芯片检测发现，并进行临床标本验证的在乳腺癌中表达上调最为明显的基因。

国内外目前关于Sema4C在肿瘤中的研究非常有限，尤其是目前尚无分泌型Sema4C蛋白的序列、浓度及检测方法的相关报道，更无相关专利。

因此，如果能够建立分泌型Sema4C的ELISA检测方法，在基础研究和临床医学检测方面都有重要的应用价值。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明提供了一种分泌型Sema4C蛋白，不仅首次证实了分泌型Sema4C蛋白的存在，并发现该分泌型Sema4C蛋白在正常人和肿瘤患者血清中的表达有显著差异，尤其在乳腺癌淋巴结转移患者血清中明显升高，并与乳腺癌患者肿瘤负荷呈显著正相关，因此能作为一种理想的血清学标记物用于乳腺癌患者的术前诊断、术后治疗效果评估及随访监测，更进一步提供了一种以分泌型Sema4C蛋白为肿瘤标志物的试剂盒，解决了膜型Sema4C蛋白不能通过Elisa检测而必须利用免疫组化技术使用不便的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：