[发明专利]一种基因分型检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种基因分型检测方法。

背景技术

目前临床实验室最常用的ABO血型的鉴定方法是血清学血凝试验和微柱凝胶实验，另外ABO血型的基因型检测多用于正反定型不符的临床个案以及疑难血型的鉴定等。血凝试验是指抗体和红细胞在液体介质中发生肉眼可见的凝集反应。根据操作的不同又分为玻片法、试管法和全自动微板法。血凝学方法属于初筛方法，但对一般弱表达的ABO血样以及凝集可疑的血样往往不能给出判读结果。微柱凝胶法(MGT)采用凝胶技术进行抗球蛋白试验可提高试验的灵敏度和特异性。但是红细胞浓度过低或过高而离心不彻底、血清中含纤维蛋白出现细胞“凝块”、细菌污染等，可能导致MGT假阴性或假阳性。针对ABO基于分子水平的基因检测目前常见的主要是引物特异性扩增(SSP)然后凝胶电泳观察条带，但该方法后续的凝胶电泳步骤最终需要目测观察结果，增大了人工误差的风险，并且因为开盖电泳也增大了实验室污染的风险。

目前HLA-B27等位基因的检测方法主要是淋巴细胞毒性实验，引物特异性扩增和流式细胞仪检测等方法。淋巴细胞毒性实验的方法由于抗体亲和力较弱，效价低，易产生交叉反应严重影响了分型结果的可靠性。引物特异扩增技术也就是传统SSP方法，虽然是基于分子水平的分型技术，但是由于操作需要电泳观察条带来判定，操作复杂并且人为误差大。采用流式细胞技术成本较高，需要洗板等，操作复杂，并且需要批量操作才有意义。不适合用于疾病快速诊断的需要。

发明内容

为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种基因分型检测方法。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

一种基因分型检测方法，包括如下步骤：

(1)将待测基因加入PCR反应液中形成混合液并封闭在PCR反应板上进行PCR扩增反应，所述PCR反应液中包含待测基因的扩增引物和特异性探针、以及内参照引物和内参照探针，所述特异性探针和所述内参照探针的5’端用荧光基团标记且3’端用淬灭基团标记，在所述PCR扩增反应前读取所述混合液的本底荧光值，在PCR扩增反应结束后读取反应后的荧光值；

(2)将所述反应后的荧光值减去所述本底荧光值，若增值大于等于90％，则判定所述待测基因为阳性，若增值小于90％则判定所述待测基因为阴性。

本发明与现有技术对比的有益效果是：本发明的反应是封闭在PCR反应板上进行，反应前和反应后的荧光值数据读取工作都在该封闭的环境中进行，PCR反应后污染的风险被完全剔除，整个操作非常的简单、方便，通过反应前后的荧光值增值来对待测基因进行分型，这样的定性分析剔除了SSP技术肉眼观察产生误差的可能。

具体实施方式

下面结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。

本发明提供一种基因分型检测方法，在具体实施方式中包括如下步骤：

(1)将待测基因加入PCR反应液中形成混合液并封闭在PCR反应板上进行PCR扩增反应，所述PCR反应液中包含待测基因的扩增引物和特异性探针、以及内参照引物和内参照探针，所述特异性探针和所述内参照探针的5’端用荧光基团标记且3’端用淬灭基团标记，在所述PCR扩增反应前读取所述混合液的本底荧光值，在PCR扩增反应结束后读取反应后的荧光值；(2)将所述反应后的荧光值减去所述本底荧光值，若增值大于等于90％，则判定所述待测基因为阳性，若增值小于90％则判定所述待测基因为阴性。

其中，各个所述特异性探针上的荧光基团以及所述内参照探针上的荧光基团均不同，荧光基团可以从以下群组中选择：FAM、HEX、TET、ROX、TAMRA和CY5；淬灭基团可以为Dabcyl。

以下通过更具体的实施例对本发明进行详细说明。

实施例一：待测基因为ABO基因的O1、O2、B、A、A2基因型

(a)提取血样中基因组DNA

使用德国inno-train公司的全血DNA提取试剂盒提取DNA，具体操作过程按其说明书进行。

(b)设计扩增引物

从GenBank中找出待检测的ABO基因序列，用Lasergene软件的MegAlign功能对比序列，在ABO各种分型基因中设计通用扩增引物，然后将扩增引物放入NCBI中的Blast进行扩增的特异性检验，以确保其只对ABO各个分型进行特异性扩增。同时设计内参照引物。设计的通用的扩增引物和内参照引物见下表1-1，其中F表示正向引物，R表示反向引物。