[发明专利]一种猪伪狂犬病毒的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于家畜疾病诊断技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病毒检测方法。

背景技术

猪伪狂犬病(PseudorabiesPR)是由猪伪狂犬病病毒(PseudorabiesvirusPRV)引起的猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的一种高度接触性、急性传染病。猪是PR主要的天然宿主和最主要的传染源。各年龄阶段的猪只均可被感染，该病在猪群多呈暴发性流行，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。目前，主要依靠接种gE基因缺失的Bartha-K61弱毒疫苗来预防本病。但是2011年以来我国多省份出现了新的毒力更强变异毒株，造成了很大的经济损失，即使接种的猪只也不能幸免于难，出现了不同年龄段猪的死亡。表明Bartha-K61弱毒疫苗已经不能提供完全的保护力。

而且，由于病毒基因组很容易发生变异，导致已有的用于检测的抗体失去效果，这就加大了对于PRV进行正确诊断的困难，因此迫切需要建立一种特异性高的PRV进行鉴别诊断的方法，从而为PR正确诊断提供科学的手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病毒的检测方法，用本发明制备的针对PRVgE蛋白的高特异性单克隆抗体，基于该单抗建立的阻断ELISA方法具有特异性高、灵敏度强、无假阳检测的特点，从而为PR准确诊断提供科学的依据。

本发明首先提供一种具有新的具有良好免疫原性的gE蛋白，较以前报道的PRV的gE蛋白，在第48位和第492～496位各有1个天冬氨酸的插入，该区域恰好处于gE蛋白抗原表位所处的结构域中，氨基酸的插入很可能改变了已知毒株存在的抗原表位，造成其致病性增强，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；

编码上述gE蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQIDNO:2；

上述的gE蛋白作为抗原用于制备抗体；

本发明再一个方面提供一种检测患病猪群抗体的阻断ELISA方法，包括如下的具体步骤：

将gE蛋白抗原经过稀释液稀释，定量包被在ELISA96孔板中，4℃过夜；

用PBST洗涤液对未结合的抗原进行清洗；

分别将阴性血清、阳性血清和待检血清加到相应的检测孔中，轻微震动，使反应板中的液体混匀；

将微量反应板密封后置于37℃孵育；

垂直倒掉反应板中的液体，并用洗涤液进行对每个孔进行清洗；

用封闭液对反应板进行封闭，置于37℃孵育；

去除反应板中的液体，并用洗涤液进行对每个孔进行清洗；

将稀释好的酶标单抗加入到每个反应孔中，置于37℃孵育；

倒掉反应板中的液体，并用洗涤液进行对每个孔进行清洗；

添加底物，置于37℃中反应；

加入终止液，终止反应，并于酶标仪读取450nm吸光度值，样品值/阴性值大于2判定为阳性，小于1为阴性。

其中阴性血清的制备方法为：未经免疫小鼠血清为阴性血清；

阳性血清是gE蛋白免疫小鼠的分离血清。

所述的封闭液为：5％脱脂奶粉

洗涤液为：含0.5‰吐温-20的PBS溶液；

所使用的酶标单抗，其制备方法为：

将用于酶标的单克隆抗体进行纯化后，对单克隆抗体进行辣根过氧化物酶(HRP)进行酶标，具体步骤如下：

称取5mgHRP溶于0.5ml蒸馏水中；

加入0.5ml0.06MNaIO4，4℃轻摇30min，溶液呈现黄绿色；

加入0.5ml0.16M乙二醇，室温下避光轻摇30min，终止氧化反应；

加入5mg抗体，装入透析袋中，置于0.05M，pH为9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中，4℃透析过夜，期间更换至少3次CBS；

取出透析袋中的液体，加入5mg/mlNaHB40.2ml，4℃过夜；

加入等体积饱和硫酸铵溶液沉淀结合物，4℃30min后，3000rpm离心15min，丢弃上清；

将沉淀物溶于PBS中，装入透析袋中，并以PBS为缓冲液透析6-12h，更换3次透析液；

最后，将获得的液体-20℃分装保存。

终止液为：2MH₂SO₄。制备方法是蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml。

本发明的通过制备具有特异性高的单克隆抗体，并建立基于该单克隆抗体检测PR毒株的方法，从而对目前流行的PR毒株具有良好的鉴别诊断的作用。

具体实施方式