[发明专利]一种虎斑兜兰组培快繁方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养研究领域，具体涉及一种虎斑兜兰组培快繁方法。

背景技术

虎斑兜兰（PaphiopedilummarkianumFowlie）是兰科兜兰亚属地生或半附生植物，中国特产种，产于云南西部，多生长在海拔1500～2000m、石灰岩地区的疏林树上、覆盖苔藓的岩石上或多石区，野生种质资源已十分稀少，叶片狭矩圆形，花大，淡黄绿色，花期6～8月，可用于植物园、盆栽、切花或布置花境，具有独特的观赏价值和育种潜力，但由于生境的破坏，人为毁灭性采挖、出售，虎斑兜成为世界上濒危的物种之一，已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》，急需采取措施加以保护。

兜兰是组培最难的兰科植物之一，有关虎斑兜兰的研究报道极少，杂交种的组织培养相对较易，原生种的组织培养较难，虎斑兜兰的茎极短，又靠近土壤生长，切取外植体十分困难，极易受菌类污染。虎斑兜兰由于单个果实内具有较多种子，因而利用种子无菌萌发培养是常用繁殖手段，但易受种源限制，由于虎斑兜兰种群数量逐渐较少，目前在野外几乎很难寻觅到自然健康生长的种群，如果长期用少数个体产生的种子进行繁殖，经过若干代以后将面临自然衰退的威胁，目前利用种子作为外植体，进行组织培养的方法尚未取得突破性进展。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，利用植物组培快繁的方法获得大量优质虎斑兜兰种苗，采用的技术方案如下：

（1）外植体灭菌：人工授粉140d后，采集未开裂的蒴果作为外植体，用75%酒精灭菌30～50s，再用10%次氯酸钠灭菌10～15min，无菌水冲洗5～7次；

（2）种子萌发培养：在无菌条件下将灭菌后的蒴果切开，将种子均匀撒播在种子萌发培养基上，在温度25±2℃，光照14h/d，光照强度1600～2000Lx条件下培养7～8周，种子发育成原球茎，所述的种子萌发培养基为1/2RE+6-BA0.6mg/L+AC1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，PH为6.0～6.5；

（3）增殖培养：将原球茎转接到增殖培养基，在温度25±2℃，光照14h/d，光照强度1600～2000Lx条件下培养8～9周，得到类原球茎和芽的混合体，所述的增殖培养基为：1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+胰蛋白胨3g/L+AC1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，PH为6.0～6.5；

（4）分化培养：将增殖培养得到的混合体转接到分化培养基，在温度25±2℃，光照14h/d，光照强度1600～2000Lx条件下培养7～8周，得到具有1～2片叶的小苗，所述的分化培养基为：1/2MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+鲜枣汁80ml/L+AC1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，PH为6.0～6.5；

（5）生根培养：将小苗转入生根培养基，在温度25±2℃，光照14h/d，光照强度2000～2500Lx条件下培养7～8周，得到根长3～4cm的试管苗，所述的生根培养基为：1/2MS+IBA0.3mg/L+NAA0.5mg/L+鲜枣汁80ml/L+AC1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，PH为6.0～6.5；

（6）炼苗移栽：将试管苗带瓶移至常温、无直射光环境下，炼苗1周，取出试管苗，用清水洗净培养基，用浸泡过的水苔包裹根部栽到营养杯中，环境要求通风良好，遮光65%～70%，空气相对湿度70%～75%，温度15～28℃，2周后试管苗即可成活。

本发明的有益效果体现在：本发明以虎斑兜兰种子为外植体，建立了组培繁殖体系，取得了虎斑兜兰组培快繁方法的突破性进展，采用本方法得到的组培苗遗传性状稳定，繁殖系数高，繁殖周期短，移栽成活率达92%以上，有利于虎斑兜兰野生资源的保护与开发，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明的种子萌发培养的示意图。

图2为本发明的增殖培养的示意图。

图3为本发明的分化培养的示意图。

图4为本发明的生根培养的示意图。

图5为本发明的试管苗移栽成活的示意图。

具体实施方式

实施例1

一种虎斑兜兰组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）外植体灭菌：人工授粉140d后，采集未开裂的蒴果作为外植体，用75%酒精灭菌40s，再用10%次氯酸钠灭菌12min，无菌水冲洗6次；