[发明专利]一种一型极化树突状细胞及其诱导方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，主要涉及一型极化树突状细胞的培养方法及其相关的应用。

背景技术

DC细胞是哺乳类动物免疫系统内唯一的专职抗原提呈细胞。其主要功能是摄取、加工处理和递呈抗原，激活或调节适应性免疫应答。成熟的DC细胞高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，MHC分子与被细胞捕获，加工的肿瘤抗原结合，形成肽-MHC分子复合物，并递呈给T细胞，进而激活MHC-I类限制性CD8阳性细胞毒性T细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)和MHC-Ⅱ类限制性的CD4阳性的一型T辅助细胞(type1Thelper,Th1)。成熟的DC细胞高表达CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等共刺激分子，为T细胞提供其活化所必需的第二信号。成熟的DC细胞在激活T细胞过程中还大量白介素12(interleukin12，IL12)等因子，促进活化的T细胞迅速增殖。此外，DC细胞还分泌一系列趋化因子，如CCL7促进T细胞在肿瘤部位的浸润，从而发挥其杀伤肿瘤的作用。

利用DC细胞的特性可以激活或增强针对病原体或肿瘤细胞的适应性免疫反应。毫无疑问，体外制备具有正常免疫功能的DC细胞具有极高临床价值与商业价值。目前大多数体外制备DC细胞方案都是基于Jonuleit等人提出诱导方法(GeneTher.200310(3))，诱导试剂包括干扰素、脂多糖(PEG2)、肿瘤坏死因子等。经过这类方案诱导成熟的DC细胞的CD80，CD40，CD86等免疫激活表型显著性增强，大量实验数据证实体外诱导成熟DC细胞具有免疫激活能力,能够有效的激活特异性免疫反应。

Kalinski等人证实了成熟的DC细胞可以分为两型，DC1与DC2，并建立多种的DC1细胞的诱导方案。DC1具有激活CTL与Th1的能力，正向调节机体的获得性免疫能力；而DC2细胞促使T调节细胞(Treg)或Th2细胞生成，减低免疫激活反应，维持机体的免疫平衡。DC1的一个重要的特征是高表达IL12p70，IL12在激活NK和T细胞的过程中至关重要。XiZhao等人用慢病毒感染的DC细胞使其持续性高表达外源性IL12，发现DC.IL12细胞能够高效的诱导抗原特异性CTL细胞的产生，将DC.IL12与肿瘤抗原肽回输至小鼠体内可显著性的缩小肿瘤肿块。Kalinski实验室也发表了多篇文章，证实了回输负载肿瘤抗原肽的DC1细胞能够有效激活癌症病人的免疫反应，使肿瘤肿块消除或缩小。因此高表达IL12的DC1的细胞是激活获得性免疫反应的优良工具。目前国内DC细胞相关的专利，如中国专利CN101481677B，CN103301449A，CN102600462A等均使用正常DC细胞激活抗原特异性反应。由于现行常规方案诱导的DC细胞的IL12表达量有限，这就意味着上述方案中DC细胞体外激活特异性CTL与Th1的能力依然有限。显而易见，高表达IL12的DC细胞对于肿瘤疫苗激活特异性免疫反应，发挥抗癌临床作用是至关重要的。

DC1细胞是成熟DC细胞的一类亚群，具有强有力的免疫激活能力。DC1细胞的重要的特征是高表达IL12p70以及免疫激活共刺激分子。因此，DC1细胞可高效的激活抗原特异性的CD8+T细胞和CD4+Th1细胞相关的免疫反应。RobbieB.Mailliard等证实了DC1体外诱导黑色素瘤抗原特异性的CTL细胞效力达到正常的成熟DC细胞的40倍以上。AdrianaTLarregina等人还发现DC1细胞诱导B16黑色素瘤抗原特异性CD4+辅助性T细胞，并且促进CD4+辅助性T细胞对肿瘤组织的浸润。DC1细胞的上述特性为增强肿瘤疫苗的治疗效果提供了一种新的策略，因此DC1细胞可以作为一种基于抗原肽癌症疫苗的佐剂，促进肿瘤抗原特异性的免疫反应激活。目前已经有大量相关文献证实了DC1能够在动物和人体内增强肿瘤抗原特异性的免疫反应，多个使用DC1细胞的肿瘤疫苗已经进入临床阶段的研究。

高效的制备DC1细胞是基于抗原肽的癌症免疫治疗的关键。现有技术中最佳的方案可获得高表达IL12的DC1细胞，但是均需要大量的细胞因子和诱导试剂，成本昂贵。此外，细胞因子批次间可能存在效价差别，对于制备的质量控制工作带来了大量的负担。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提出了一种体外诱导一型极化树突状细胞的方法，利用脐带血自然杀伤细胞(NaturalKillercell，NK)在DC细胞激活适应性免疫过程中的辅助作用，建立了一种新的DC1细胞制备方法，制备的细胞不仅显现出成熟DC细胞表型，IL12p70的表达量显著性提高，而且其体外诱导肿瘤细胞特异性CTL的能力也获得加强。