[发明专利]一种环状芽孢杆菌的高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程和微生物育种的技术领域，涉及一种产β-半乳糖苷酶的环状芽孢杆菌的高通量筛选方法。

背景技术

低聚半乳糖主要是以乳糖为原料通过微生物β-D-半乳糖苷酶催化半乳糖基转移反应来生产的，产物主要是三糖(4'或6'-半乳糖基乳糖)和少量的四、五、六糖。低聚半乳糖的化学式为(半乳糖)n-葡萄糖，n＝2～4。低聚半乳糖结构上连接半乳糖基与半乳糖基的糖苷键类型为β(1→3)，β(1→4)，β(1→6)，其中以β(1→4)为主。β-D-半乳糖苷酶可以催化半乳糖基转移至葡萄糖的C2、C3、C6位，生成除了β(1→1)之外的所有可能的糖苷键类型的半乳糖基转移二糖。

不同菌种代谢产生的β-半乳糖苷酶作用特异性不同，作用于乳糖后生成的低聚半乳糖含量和结构不同，这种特异性的差异在不同种类的菌中尤为明显，如环状芽孢杆菌或罗伦隐球酵母菌生产的β-半乳糖苷酶催化时，半乳糖单元间的糖苷键主要是β(1→4)键，而用米曲霉或嗜热链球菌产生的酶催化，糖苷键主要是β(1→6)键。有相关报道证实，目前已有60多种的低聚半乳糖结构。

微生物β-D-半乳糖苷酶易于大量制备、稳定性好。因此，β-D-半乳糖苷酶适合于生产低聚半乳糖。β-D-半乳糖苷酶来源广泛，不同种类微生物产生的β-D-半乳糖苷酶不仅表现在分子量、最适pH值、最适温度、热稳定性等酶学性质方面的差异。从自然界直接分离的菌种，一般而言其酶发酵活力往往是比较低的，不能达到工业生产的要求，因此要根据菌种的形态、生理上的特点，改良菌种。为了使酶更适合于实际应用，采取不同的方法、从不同角度对现有菌种和酶进行改造，以期获得比天然酶更高的活力或不同的催化活性，提高酶的应用价值。以微生物的出发菌株自然变异为基础的生产选种的概率并不高，仅为10^-6～10^-10。为了加大其变异率，采用物理和化学因素促进其诱发突变，以提高菌种产量、性能的主要手段。诱变育种不仅能提高菌种的生产性能，而且能改进产品的质量、扩大品种和简化生产工艺等。从方法上讲，它具有方法简便、工作速度快和效果显著等优点。因此，在育种方法上，虽然杂交、转导以及基因工程、原生质体融合等方面的研究都在快速地发展，但诱变育种仍为目前比较主要、广泛使用的育种手段。

目前相关研究报导证明环状芽孢杆菌是β-半乳糖苷酶的重要来源，且所产β-半乳糖苷酶对乳糖具有理想的转化效果。利用环状芽孢杆菌生产β-半乳糖苷酶具有显著的应用价值。

突变菌株的筛选一般多用筛选培养基在摇瓶中发酵培养，该筛选方法存在筛选工作量大、筛选效率低等问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺点与不足，提供一种高产β-半乳糖苷酶的环状芽孢杆菌的高通量筛选方法。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种环状芽孢杆菌的高通量筛选方法，包括以下步骤：

(1)出发菌活化：将环状芽孢杆菌进行划线培养，挑取单菌落于新鲜的LB培养基中培养，然后离心收集菌体，重新悬浮于无菌水中；

(2)紫外诱变：将步骤(1)细胞悬浮液用紫外灯照射；

(3)氯化理诱变：照射处理后的菌液，立即放入新鲜的LB培养基中，避光培养，并稀释菌液浓度，红光下涂布于含LiCl的LB平板进行培养；

(4)菌株的筛选：向步骤(3)中诱变获得的突变株中滴入X-gal溶液，观察菌落的显色情况，筛选菌落变深蓝的突变株，接种于含有培养基的96孔板；

(5)将上述96孔板置于摇床中培养，通过检测β-半乳糖苷酶活力进行筛选，得到F1代；

(6)将F1中β-半乳糖苷酶活力最高的菌株重复步骤(2)～(5)，得到高产β-半乳糖苷酶的环状芽孢杆菌菌株。

进一步地，步骤(1)所述环状芽孢杆菌的孢子浓度为10⁵～10⁸个/mL。

进一步地，步骤(3)所述LiCl的含量是0.05～1.0wt％。

进一步地，步骤(4)所述的X-gal溶液的配制方法为：将20mgX-gal用100mL二甲基甲酰胺进行漩涡混合溶解，再用锡纸包裹避光，置-20℃保存。

进一步地，步骤(4)所述96孔板为2mL深孔板，每孔装液量为500～1200μL。

进一步地，步骤(4)所述培养基的组成为：1.2wt％的大豆蛋白胨、0.65wt％的酵母抽提物、0.35wt％的磷酸氢二钠、0.25wt％的碳酸钠、0.55wt％的硫酸镁、1.5wt％的乳糖和95.50wt％的水。