[发明专利]一种环状芽孢杆菌的高通量筛选方法

权利要求书

1.一种环状芽孢杆菌的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)出发菌活化：将环状芽孢杆菌进行划线培养，挑取单菌落于新鲜的LB培养基中培养，然后离心收集菌体，重新悬浮于无菌水中；

(2)紫外诱变：将步骤(1)细胞悬浮液用紫外灯照射；

(3)氯化理诱变：照射处理后的菌液，立即放入新鲜的LB培养基中，避光培养，并稀释菌液浓度，红光下涂布于含LiCl的LB平板进行培养；

(4)菌株的筛选：向步骤(3)中诱变获得的突变株中滴入X-gal溶液，观察菌落的显色情况，筛选菌落变深蓝的突变株，接种于含有培养基的96孔板；

(5)将上述96孔板置于摇床中培养，通过检测β-半乳糖苷酶活力进行筛选，得到F1代；

(6)将F1中β-半乳糖苷酶活力最高的菌株重复步骤(2)～(5)，得到高产β-半乳糖苷酶的环状芽孢杆菌菌株。

2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述环状芽孢杆菌的孢子浓度为10⁵～10⁸个/mL。

3.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(3)所述LiCl的含量是0.05～1.0wt％。

4.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(4)所述的X-gal溶液的配制方法为：将20mgX-gal用100mL二甲基甲酰胺进行漩涡混合溶解，再用锡纸包裹避光，置-20℃保存。

5.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(4)所述96孔板为2mL深孔板，每孔装液量为500～1200μL。

6.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(4)所述培养基的组成为：1.2wt％的大豆蛋白胨、0.65wt％的酵母抽提物、0.35wt％的磷酸氢二钠、0.25wt％的碳酸钠、0.55wt％的硫酸镁、1.5wt％的乳糖和95.50wt％的水。

7.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)出发菌活化：将环状芽孢杆菌进行划线培养，挑取单菌落于新鲜的LB培养基中，30～40℃培养4～12h后，10000rmp离心10min收集菌体，重新悬浮于无菌水中；

(2)紫外诱变：将步骤(1)细胞悬浮液置于距离30w紫外灯25cm处，照射15～30min；

(3)氯化理诱变：照射处理后的菌液，立即放入新鲜的LB培养基中，避光培养2h，并稀释菌液浓度，红光下涂布于含LiCl的LB平板，30～40℃下培养24h；

(4)菌株的筛选：向步骤(3)中诱变获得的突变株中滴入0.02wt％的X-gal溶液，观察菌落的显色情况，筛选菌落变深蓝的突变株，接种于含有培养基的96孔板；

(5)将上述96孔板置于摇床中培养，30～40℃、100～300r/min培养36～48h，通过检测β-半乳糖苷酶活力进行筛选，得到F1代；

(6)将F1中β-半乳糖苷酶活力最高的菌株重复步骤(2)～(5)，重复2～5次，得到高产β-半乳糖苷酶的环状芽孢杆菌菌株。