[发明专利]Y染色体AZF区微缺失检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种检测Y染色体AZF区微缺失的检测试剂，包括引物组合物，针对Y染色体AZF区域和其他作为内部参考的特异性区域选定的引物位点设计了引物序列，这些引物序列的特点为：（1）每组引物均是以基因组上一段序列为模板来设计三条连续的引物，这三条引物连接后形成PCR模板；（2）在正常人染色体目标区域，引物位点序列存在已知且不变的拷贝数，且在目标区域之外的其他染色体区域不存在该序列；（3）这些序列引物具有接近的退火温度，波动范围<5℃；（4）与通用扩增引物序列不存在互补性；（5）内参位点仅在目标区域唯一出现，在基因组其他区域不存在该位点。还提供了检测Y染色体AZF区微缺失的试剂盒以及检测Y染色体AZF区微缺失的方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用gDNA或外周血游离DNA检测Y染色体AZF区微缺失的试剂盒及使用该试剂盒体外检测Y染色体AZF区微缺失的方法。

背景技术

有研究报告指出，不育夫妇占已婚育龄夫妇的15％，其中男性因素约占一半，而男性不育症35％是由于遗传因素造成。Y染色体微缺失是除克式综合征外男性不育的最主要遗传因素。Y染色体大量的重复序列和回文结构在维持Y染色体进化稳定性的同时，也使Y染色体更容易发生结构重排，导致染色体部分缺失或重复。Y染色体微缺失主要发生在Y染色体上的AZF(azoospermia factor)区。AZF区包括AZFa、AZFb、AZFc三个亚区，这些位置包括许多与精子形成有关的基因，这些区域的完全缺失或部分缺失可引起男性精子发生障碍、少精、弱精甚至无精症状。

检测Y染色体AZF区微缺失现在已经成为男性不育专科的常规检查，可以为男性不育患者找出病因，为遗传咨询提供依据；也为临床医生的诊断与后续治疗提供指导。所以一种简单快速、准确度高且低成本的检测方法对临床具有重大意义。

目前检测Y染色体AZF区微缺失的方法有很多，例如多重PCR、实时荧光PCR、芯片杂交、MLPA等技术，最常用的是使用多重PCR扩增序列标签位点(Sequence Tagged Site,STS)。该方法选择AZFa、AZFb、AZFc区的STS序列进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，根据条带的有无判断AZF各区是否发生缺失。欧洲男科协会(European Academy of Andrology,EAA)和欧洲分子遗传质控网(European Molecular Genetics Quality Network,EMQN)联合发布的《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》推荐了多重PCR检测Y染色体AZF区微缺失的6个STS(AZFa：sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255)。在此基础上，各个检测实验室可选择性地增加STS的数量进行更精确的检测。这种方法简单易行，目前使用最广泛。但是这种方法扩增的STS位点较少(6个或以上)，而且电泳只能定性检测目的产物是否存在，不能检测拷贝数的变化，这对于Y染色体AZF区部分缺失的情况可能检测不精确，所以这种方法在检测准确度和灵敏度上还有待提高。其中一个方法是增加检测的STS数量，但这需要进行多次多重PCR反应，从而大大增加实验工作量和检测成本。

检测Y染色体AZF区微缺失还可以使用多重实时荧光PCR，这种方法简便快速更准确，但是探针设计繁琐并且需要报告基团修饰，价格昂贵，不适合临床推广使用。

有文献报导采用芯片杂交技术检测Y染色体AZF区微缺失，相比于多重PCR技术，可以极大地提高检测的准确度和灵敏度。但缺点是该方法需要设计大量的探针，成本较高，另外检测信号分析也较为复杂，不适合临床医生判读。

MRC-Holland公司推出一款SALSA MLPA probe-mix kit P360-A1试剂盒，用于Y染色体AZF区微缺失的检测，通过杂交、连接手段获取探针相对拷贝数信号，并根据产物长度识别对应探针，最终通过探针信号给出检测结论。该技术手段与芯片杂交技术一样，面临着检测信号分析复杂的缺陷，另外由于需要根据产物长度识别探针，在探针设计和识别上有着一定的局限性。