[发明专利]焦磷酸测序法检测CYP2C9基因分型的引物对及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种焦磷酸测序法 检测CYP2C9基因分型的引物对及试剂盒。

背景技术

细胞色素P4502C9(CytochromeP4502C9，CYP2C9)占肝微粒 体细胞色素P450总量的20％，能催化代谢许多临床常用药物，其在 临床药物代谢中的重要性越来越受到重视。

CYP2C9基因具有高度遗传多态性，其最常见的基因突变位点是 CYP2C9*2(rs1799853)和CYP209*3(rs1057910)，其编码的酶活 性分别比野生型CYP2C9*1降低了30％和80％，影响其底物药物在 体内的代谢，造成药物疗效和毒性的个体差异，导致CYP2C9基因突 变个体对华法林的需求剂量较低。携带这两个等位基因的个体服用华 法林后达到稳态浓度需要的时间较长，且在使用初期有较高出血危险 性，因此CYP2C9*2或CYP2C9*3基因型个体服用华发林时应减少 剂量，但是等位基因突变个体长期治疗过程中过度抗凝的危险性没有 增加。其他突变体CYP2C9*4，CYP2C9*5，CYP2C9*6以及CYP2C9*1l 等在人群中突变频率很低，其对华法林需求剂量的影响还有待于进一 步研究。CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因频率在不同种族中有较大 差异，其中，在高加索人中，CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因频率 大约分别是8％-20％和6％-10％；在亚洲人群中，CYP2C9*2等位基 因不存在，CYP2C9*3等位基因频率大约是l％-4％；在美洲黑人中， CYP2C9*2等位基因频率大约是2％-4％，CYP2C9*3等位基因频率大 约是l％-2％。

华法林是一种双香豆素衍生物，是目前临床上应用最广泛的口服 抗凝药物之一，用于预防和治疗深静脉血栓、肺栓塞、心脏瓣膜置换 术及房颤导致的血栓形成。华法林治疗窗较窄，很小的剂量都可能导 致不良反应的发生，且在不同个体达到相同作用效果，高低剂量者之 间可相差10倍以上。华法林是由S-华法林和R-华法林组成的消旋体， 在体内S-华法林反映了60％-70％的抗凝活性，而R-华法林占 30％-40％，其中S-华法林主要由CYP2C9代谢，故CYP2C9基因多 态性对华法林剂量使用有较大影响。临床研究结果显示：达到相同抗 凝效果时，CYP2C9*2和CYP2C9*3基因型患者华法林的使用剂量较 野生型患者低；此外，美国食品药品监督管理局(FDA)明确指出： 在使用华法林时，建议检测CYP2C9基因型。因此，患者CYP2C9 基因型与临床用药中华法林的正确合理使用存在显著的相关性。

焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序 (即，确定DNA中核苷酸的顺序)方法，属于新一代DNA序列分 析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、 特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催 化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中， 只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入 到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化 为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度 与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续 DNA链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定DNA序列的 目的。不过，现有技术中还没有利用焦磷酸测序技术检测CYP2C9 基因分型的产品。

目前，在现有技术中，尤其是在医院内，采用有“金标准”之称 的PCR-直接测序法对CYP2C9基因进行检测，但该方法的敏感性不 高，只能检测出突变细胞比率在10-20％以上的肿瘤组织及外周血， 对于突变细胞比率小于10％的肿瘤组织及外周血，常规PCR-直接测 序法几乎无能为力；此外，该方法还存在成本高、检测周期长及操作 繁琐的缺点。

发明内容

为了解决上述方法检测CYP2C9基因分型过程中存在敏感性不 高、检测周期长、操作繁琐及成本高的技术问题，本发明提供一种敏 感性高、特异性强、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求 的焦磷酸测序法检测CYP2C9基因分型的引物对及试剂盒。

本发明提供了一种焦磷酸测序法检测CYP2C9基因分型的引物 对，所述CYP2C9基因检测的多态性位点为CYP2C9*2和/或 CYP2C9*3，所述引物对包括：