[发明专利]一种用于端粒酶检测的探针、方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测端粒酶活性的亲疏水可控的复合探针，以及用该类探针来检测端粒酶活性的方法和试剂盒。本发明的复合探针由共轭芴分子CF与端粒酶引物Ts通过酰胺键结合。通过调控亲水材料在复合探针中的比例，可改变复合探针的亲/疏水性能。在有端粒酶存在时，本发明的复合探针在一定的条件下会以TTAGGG重复片段扩增，扩增产物中的疏水材料CF在均相水溶液中以分散状态存在，释放荧光。将其用荧光仪检测，即可得到不同浓度的端粒酶样品对应的荧光强度。本发明的检测方法制备和操作简单，灵敏度高，检测成本低，所需样品少，响应迅速且特异性好。

技术领域

本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种亲疏水性可控的复合探针、使用该探针检测端粒酶的方法以及其试剂盒。

背景技术

端粒酶(telomerase)是一种自身携带模板的逆转录酶，是由蛋白质和RNA两部分组成的核糖蛋白复合体。其中RNA部分是一段较短的模板序列，能够与端粒DNA重复序列(TTAGGG)互补并指导它的合成，而蛋白质部分具有逆转录酶的活性，它能以RNA为模板催化端粒DNA重复序列的合成，并将其加到端粒的3’端，以维持端粒的长度及功能。端粒酶在保持基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤细胞中被重新激活，研究结果显示在已知的85％的肿瘤当中都发现了端粒酶的高表达。端粒酶也被认为是癌症早期诊断和靶向治疗的生物标志物，因此，建立一系列简单、快速、高灵敏度、高选择性、低花费、高通量的策略和技术用于端粒酶的检测是十分必要的。

近十年来，许多研究小组开发了一些新技术和方法用于端粒酶活性的检测。早在1994年，Kim等就建立了一种超高灵敏度的端粒重复序列扩增方法(telomeric repeatamplification protocol,TRAP)用于端粒酶活性的检测。这种方法主要包括端粒酶引物延伸反应和端粒重复序列的PCR扩增反应。尽管这种端粒重复序列扩增方法非常有效，大大提高了端粒酶检测的灵敏度，但是它是基于DNA聚合酶的聚合酶链扩增反应(PCR)，比较费时，容易受到细胞提取物的抑制出现假阴性结果，而且需要昂贵的仪器和试剂。近年来，广大科研工作者利用光学表面等离子体共振、电化学、石英晶体微天平等技术开发了一系列的方法用于端粒酶活性的检测。Willner等首次报导了基于催化脱氧核酶的电化学生物传感技术用于端粒酶的检测。另有研究报导一种非聚合酶链反应的电化学方法用于端粒酶活性的检测。该方法主要是通过对端粒重复序列上鸟嘌呤的电化学氧化信号来实现对端粒酶的检测，这种方法不需要任何标记，在较低蛋白浓度的细胞提取物中都可以检测到端粒酶。但是这种微分脉冲伏安法的检测范围比较窄，只能从1000个HeLa细胞检测到3000个HeLa细胞，当样品超过3000个HeLa细胞时，将无法检测到依赖于端粒酶浓度的微分脉冲伏安信号。同时，有大量文献报道运用荧光信号检测端粒酶活性的方法，但都存在标记复杂或检测灵敏度、特异性不高的问题。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种亲疏水可调控的复合探针，利用检测过程中探针亲疏水变化导致其荧光信号变化的性能来实现快速的一步法检测端粒酶的活性，由此解决现有技术中检测仪器昂贵、实验操作复杂、检测范围窄、灵敏度不高且实际应用性弱的技术问题。本发明异于一般的荧光检测方法，即检测探针无需荧光分子、猝灭基团双标记，探针制备更为简单。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于检测端粒酶活性的亲疏水性可调控的复合探针，该复合探针由聚集猝灭的共轭芴CF分子与端粒酶引物Ts通过酰胺键结合，为CF-c-Ts，其中，所述端粒酶引物Ts包括如SEQ NO:1所示的核苷酸序列。

优选地，所述的含有活性酯的共轭芴分子CF的结构式如式(I)所示：

其中，R为C₁-C₁₀的直链烷基，R优选为C₆-C₈。