[发明专利]基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒

说明书

本发明属于基因突变检测领域，尤其涉及利用Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法和试剂盒。为了克服现有人类EGFR基因突变检测方法及试剂盒的不足,本发明提供了一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，由于在EGFR基因片段扩增体系中引入耐热DNA连接酶和针对突变位点的特定连接引物体系，极大抑制了样品中的野生型EGFR基因片段的扩增，可以基于扩增片段条带直接判定野生型样本；或使得低突变含量样品其最终的PCR产物中突变片段的比例高于50%，从而保证了Sanger测序对于杂合基因片段体系的准确识别；本发明方法及试剂盒可以基于Sanger测序检测出样本中含量低至1%的EGFR基因突变，准确率极高，检测费用低廉并且还可能测出新的未知突变。

技术领域

本发明属于基因突变检测领域，尤其涉及利用Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法和试剂盒。

背景技术

人类表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）是一种由原癌基因C-erbB-1(HER-1)编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，广泛表达于大部分正常上皮细胞中。然而在许多实体肿瘤（如非小细胞肺癌）中往往存在EGFR高表达或异常表达的情况，这与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡的抑制有关，因此EGFR已经成为相关肿瘤（尤其是非小细胞肺癌）靶向治疗的一个重要靶点。目前应用于临床的EGFR靶向药物包括:EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs,如吉非替尼即易瑞沙和厄罗替尼即特罗凯)，以及EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗。大量研究表明, 吉非替尼（Gefitinib）和厄罗替尼（Erlotinib）的疗效与EGFR基因尤其是其18-21号外显子的突变状况密切相关。携带EGFR基因突变的肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂高度敏感，患者将得到很大的受益；反之野生型基因的患者将基本不受益，因此EGFR基因检测作为非小细胞肺癌等癌症靶向药物选用的前提被列入了最新的NCCN（美国国家综合癌症网络）肿瘤临床实践指南。

目前报导的EGFR基因突变检测方法包括Sanger测序、Scorpions-ARMS、TaqMan-qPCR、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP等,其中在临床和科研中较为常用的方法为Sanger测序法和Scorpions-ARMS(Scorpions，蝎形探针；Amplification refractory mutation system,扩增阻滞突变系统)法。基于Scorpions-ARMS法开发的如德国Qiagen公司的EGFR检测试剂盒，可同时检测EGFR基因的29种常见突变,具有灵敏度高（可测出低至1%水平的突变），操作简单，快速检测等优点；然而该类进口试剂盒检测成本过高（每份标本需3000-5000元）限制了其临床的推广和应用。Sanger测序法是基因突变/多样性检测的金标准，具有技术和平台成熟、结果准确和全面等优点，相比于Scorpions-ARMS法，检测费用低廉并且还能测出未知突变；然而Sanger测序法主要的不足在于检测灵敏度约10-20%左右（即突变基因含量要大于10%甚至20%才能被可靠检出），这制约了其临床应用。由于体细胞突变组分只占临床等样本中的一部分，除此之外还可能存在大量的野生型基因，因此提高在大量正常基因背景中少量突变检测的灵敏性，是目前改进或者开发方法的关键。

发明内容

为了克服现有人类EGFR基因突变检测方法及试剂盒的不足, 本发明的目的之一在于提供一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒；本发明的另一个目的在于提供一种基于Sanger测序的灵敏检测人类EGFR基因突变的方法。

由于本发明在EGFR基因特定片段的扩增体系中加入了耐热DNA连接酶和针对突变位点的连接引物，导致样品中的野生型EGFR基因片段的扩增将受到有效的抑制，而突变型的扩增则基本不受影响；因此使得突变含量低至1%的样品其最终的扩增产物中突变片段的比例高于50%，从而保证了Sanger测序对于杂合基因片段体系的准确识别。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：