[发明专利]基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的引物，其特征在于：所述引物由扩增引物组和连接引物组组成，所述连接引物组的核苷酸序列如SEQ.ID NO.9- SEQ.IDNO.26所示，所述引物必须同耐热DNA酶在同一反应体系下共同使用。

2.一种基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是在EGFR基因片段扩增体系中加入了如权利要求1所述的连接引物组、耐热DNA连接酶及其缓冲液。

3.根据权利要求2所述的基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、8条扩增引物、18条连接引物、耐热DNA连接酶和耐热DNA连接酶缓冲液；所述8条扩增引物其序列如SEQ.ID NO.1- SEQ.IDNO.8所示，其中SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2、SEQ.ID NO.3和SEQ.ID NO.4 、SEQ.ID NO.5和SEQ.ID NO.6、SEQ.ID NO.7和SEQ.ID NO.8分别用于靶向第18、19、20、21号外显子片段的扩增；所述18条连接引物其序列如SEQ.ID NO.9- SEQ.ID NO.26所示，其中SEQ.ID NO.9和SEQ.ID NO.10靶向第18号外显子的3种突变位点，SEQ.ID NO.11和SEQ.ID NO.12靶向第19号外显子的19种突变位点，SEQ.ID NO.13-SEQ.ID NO.22靶向第20号外显子的5种突变位点，SEQ.ID NO.23-SEQ.ID NO.26靶向第21号外显子的2种突变位点。

4.根据权利要求3所述的基于Sanger测序灵敏检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5 U/μL ，具有耐热性能；所述PCR缓冲液是由pH=8.3的100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl和15mmol/L MgCl₂组成；所述dNTPs是由dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mmol/L混合而成的；所述扩增引物的浓度均为10μmol/L ；所述连接引物的浓度均为10μmol/L ；所述耐热DNA连接酶的酶活力单位浓度不低于4000 U/μL ，在正常体系下95度保温1h酶活力不低于原酶活的60%；所述耐热DNA连接酶缓冲液的配制为20 mM Tris-HCl、25 mM 乙酸钾、10 mM 乙酸镁、1 mM NAD、10 mM DTT、0.1% TritonX-100，pH=7.6。