[发明专利]炭疽毒素受体CMG2与人血清白蛋白的融合蛋白

说明书

本发明公开了一种融合蛋白，所述融合蛋白第一部分为重组炭疽毒素受体CMG2，第二部分为重组人血清白蛋白，所述第一部分与第二部分由连接肽连接，所述融合蛋白在体内半衰期较重组炭疽毒素受体CMG2增加了近20倍，同时还具有很好的体内活性，能够完全保护被攻毒的实验动物。

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，属于多肽技术领域。

背景技术

炭疽病是由炭疽芽胞杆菌引起的人畜共患烈性传染病。由于炭疽芽胞杆菌形成的芽胞对外界环境的抵抗力强，因此其是一种潜在的生物战剂和生物恐怖病原体。炭疽杆菌的两个主要毒力因子为荚膜和外毒素，其中外毒素被认为是炭疽芽胞杆菌致病的关键因子。外毒素由三种蛋白组成：保护性抗原(Protective Antigen，PA)、致死因子(LethalFactor，LF)、水肿因子(Edema Factor，EF)。EF是一种钙离子依赖的腺苷酸环化酶，能够上调细胞内cAMP水平；LF是一种锌离子依赖的金属酶，可以阻断MAPKK信号通路；PA与细胞膜上的受体结合是LF和EF进入细胞发挥生物学作用的关键步骤。细胞膜上有两种炭疽毒素受体：TEM8/ANTXR1受体(Tumor Endothelial Marker 8/Anthrax Toxin Receptor 1)和CMG2/ANTXR2受体(Capillary Morphogenesis Protein 2/Anthrax Toxin Receptor 2)，CMG2即毛细管形态发生蛋白2。近期，在条件敲除小鼠模型中的试验结果提示，CMG2在介导炭疽毒素发挥作用导致宿主死亡的过程中发挥主要作用，而TEM8在此过程中仅发挥部分作用。CMG2最初在人类的胎盘组织中被发现，其基因在人类脐带静脉血管的内皮细胞中特异性上调，在胶原蛋白毛细血管形成中被高水平诱导表达，并且能够特异性地结合IV型胶原蛋白和层粘连蛋白。CMG2作为炭疽毒素受体，被命名为ANTXR2；根据结构可将CMG2划分为信号肽、胞外区、跨膜区、胞内区等区域；而与炭疽毒素结合位点位于胞外区，更明确的说位于胞外区的vWA结构域(命名为soluble CMG2，sCMG2，即可溶性CMG2)。虽然两种炭疽毒素受体的氨基酸同源性约为40％，vWA结构域的氨基酸同源性高达60％，但是二者与PA的亲和力却不尽相同。有研究显示，SPR法测得与PA的亲和力方面，哺乳动物细胞表达的sCMG2较sTEM8(可溶性TEM8，soluble TEM8)高1000倍以上，因此CMG2成为了炭疽受体相关研究的主要分子。类受体(可溶性受体样分子)作为炭疽特异性治疗药物不仅可以中和野生型PA的作用，而且针对PA突变体同样能够起到阻断炭疽毒素发挥作用的目的。但是，作为一种治疗用蛋白药物，sCMG2在体内的半衰期较短，其消除半衰期仅为24分钟左右。因此，一些研究将sCMG2与抗体Fc段进行融合，通过构建融合蛋白的方式延长类受体的体内半衰期。有研究报道，将炭疽毒素受体胞外vWA结构域与人IgG-Fc融合，形成双分子的抗体样结构(vWA-Fc)，可以提高类受体的半衰期，亲和力可以达到0.2nmol/L；在炭疽芽胞攻击小鼠模型上，vWA-Fc在50μg/只的剂量下就可以完全保护实验动物。除了用哺乳动物细胞来表达Fc融合的类受体分子外，有研究报道利用植物表达系统也同样获得了活性很好的CMG2-Fc蛋白。在炭疽芽胞攻击家兔模型中，2mg/kg的剂量可以完全保护100×LD₅₀的Ames芽胞攻击的家兔，同时这种表达系统较哺乳动物表达系统成本低，可以作为大规模生产的一种方法。另外，研究人员通过计算机辅助设计，将sCMG2上的117位氨基酸突变后与人IgG-Fc融合，将sCMG2与PA的亲和力提高了近4倍，该融合蛋白CMG2(E117Q)-Fc与PA摩尔比0.5：1时能够保护炭疽毒素攻击的Fisher344大鼠。但是也有文献报道，融合Fc的策略虽然能够延长类受体的体内半衰期，却不能够最终保护实验动物，仅仅能够延长实验动物的存活时间。研究人员推测因为Fc融合蛋白与PA结合后，在体内形成稳定的复合物，从而长时间存在于血液循环系统中，因动态平衡导致PA缓慢释放，造成实验动物最终死亡，在本发明人的试验中也观察到了类似的现象。同时由于Fc还可能介导ADCC或CDC等其他效应，对于延长类受体的体内半衰期而言这些功能并不必要，反而可能引起其他不可控的作用。