[发明专利]一种用于鉴定蛤蚧的PCR方法及其特异引物

说明书

本发明公开了一种用于鉴定蛤蚧的PCR方法及其特异引物。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的引物对，具体为如下(a)或(b)所示的引物对：(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。本发明通过分析蛤蚧与其混伪品的细胞色素c氧化酶I基因序列，获得蛤蚧高特异性区域，设计鉴别引物，采用特异性PCR技术实现了蛤蚧及其混伪品的准确鉴别，并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行检测，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。

技术领域

本发明属于中药材鉴定领域，涉及一种用于鉴定蛤蚧的PCR方法及其特异引物。

背景技术

蛤蚧为壁虎科动物蛤蚧Gekko gecko Linnaeus的干燥全体，收载于2010年及即将实施的2015年版《中国药典》。蛤蚧具有补肺益肾，纳气定喘，助阳益精的功效，在临床上主要用于肺肾不足，虚喘气促，劳嗽咳血，阳痿，遗精等。

以蛤蚧为主要原料的中成药，如蛤蚧精、蛤蚧补肾丸、蛤蚧定喘丸等应用广泛，用量甚大。当前国内大壁虎的数量已急剧减少，几近枯竭，早在1989年1月，林业部与农业部联合颁布《国家重点保护野生动物名录》中，就已将蛤蚧列为国家II级保护动物。近年来随着蛤蚧资源的缩减，已有蛤蚧的伪品出现。据文献资料，市场上出现过的蛤蚧伪品多达18种，包括东方蝾螈、中国瘰螈、变色树蜥、无蹼壁虎、多疣壁虎、红螺疣螈、喜山岩蜥、青海沙蜥、石龙子、变色沙蜥等。市场中也存在蛤蚧的伪品，Liu等使用分子检测技术对9批蛤蚧样品进行分析，发现只有3批为正品蛤蚧。对其中一些品种，蛤蚧正品与之形态学特征差别细微，传统的鉴别方法很难对蛤蚧药材进行鉴定。尤其是经过炮制加工、运输储藏后，甚至切片分类后，市场流通的商品蛤蚧形态有所改变，蛤蚧及其混伪品的性状特征消失，难以区分。

此外，也有研究表明可采用DNA测序技术进行鉴别，但DNA测序技术鉴别结果不够直观，操作略显复杂，不能满足快速鉴别的需求。为确保药材市场中蛤蚧的质量及其临床疗效，需要建立快速、准确、科学性强、使用方便的方法进行鉴定。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的引物对。

本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的引物对，具体为如下(a)或(b)所示的引物对：

(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。

所述引物对中，两条单链DNA分子既可以分别单独包装，也可以按照摩尔比为1:1的比例混合后包装在一起。

本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的试剂盒。

本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的试剂盒，具体可含有所述引物对、dNTP和DNA聚合酶。

根据需要，所述试剂盒中还可含有荧光染料SYBR Green I。

制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。

制备所述引物对的方法，具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。

制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。

制备所述试剂盒的方法，具体可包括如下A)或B)的步骤：

A)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内：