[发明专利]一种用于鉴定蛤蚧的PCR方法及其特异引物

权利要求书

1.用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的引物对，为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。

2.用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物对、dNTP和DNA聚合酶。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有荧光染料SYBRGreen I。

4.制备权利要求1所述引物对的方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。

5.制备权利要求2或3所述试剂盒的方法，包括如下A）或B）的步骤：

A）将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内：

B）将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP、DNA聚合酶和SYBR Green I包装于同一个试剂盒内。

6.权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧中的应用。

7.利用权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧的方法，包括如下步骤：

（a）从待测中药样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；

（b）为如下（b1）或（b2）：

（b1）根据步骤（a）所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧：若PCR产物中含有412 bp的DNA片段，则所述待测中药样品中含有或候选含有中药蛤蚧；若PCR产物中不含有412 bp 的DNA片段，则所述待测中药样品中不含有或候选不含有中药蛤蚧；

（b2）向步骤（a）扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBR Green I，得到含有荧光染料的体系，按照如下方法确定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧：若观察到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品中含有或候选含有中药蛤蚧；若观察不到所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品不含有或候选不含有中药蛤蚧。

8.利用权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品的方法，包括如下步骤：

（a）从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；

（b）为如下（b1）或（b2）：

（b1）根据步骤（a）所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品：若PCR产物中含有412 bp的DNA片段，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧正品；若PCR产物中不含有412 bp的DNA片段，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧伪品；

（b2）向步骤（a）扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBR Green I，按照如下方法确定待测中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品：若观察到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧正品；若观察不到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品为或候选为蛤蚧伪品；

所述待测中药样品为蛤蚧正品或蛤蚧伪品；所述蛤蚧正品为中药蛤蚧；所述蛤蚧伪品选自变色树蜥、变色沙蜥、丽斑麻蜥、红螺疣螈、中国石龙子和无蹼壁虎的任一种或任几种。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：在步骤（a）中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度为60-68℃。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：在步骤（b2）中，确定所述含有荧光染料的体系是否产生绿色荧光是在365 nm紫外波长下进行检测的。

11.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述412bp的DNA片段为序列表中序列3所示的DNA片段。