[发明专利]检测氧化乐果的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测氧化乐果的酶联免疫试剂盒，其适用于蔬菜中氧化乐果测定。

技术背景

近年来，有机磷农药(organophosphorus pesticides, Ops)由于具有高效和使用成本低等特点，在世界农业中起着极其重要的作用，是主要的杀虫剂之一。有机磷农药属于中、高毒性农药，具有内吸毒性，在环境中残留量大，大部分难降解，在保护农作物的同时，也造成环境的严重污染，并且直接或间接危及人体健康。氧化乐果属于有机磷农药中应用最广、最多的一种，与其他有机磷农药一样其优点和危害同时井存:氧化乐果采用高浓度灌根施药即导致土壤污染，污染的土壤再经雨水冲刷流入河水中，导致水污染;在防治地面作物害虫时，通常采用涂茎或喷洒的方法施药，药物被植株的茎、叶吸进植株体内，在杀灭害虫的同时造成氧化乐果在植物体内大量残留，通过食物链产生毒害作用，及时发现和检测氧化乐果残留具有十分重要的实际意义。近年来，对有机磷农药残留检测的研究越来越多，手段与方法也不断更新，常见的方法主要有波谱法、色谱法和酶抑制法。波谱法灵敏度不高，一般只做为定性的鉴别方法用于粗选;色谱法是目前检测有机磷农药的最主要检测方法，又分为气相色谱、薄层色谱法和高效液相色谱法三类，气相色谱法是进入20世纪50年代以后，在柱层析的基础上发展起来的一种新型的仪器分析方法，是目前应用最广的分析方法;薄层色谱法受分析的灵敏度、定量困难的制约，应用较少;液相色谱法与气相色谱法相比，不受样品的挥发度和热稳定性的限制，适合于大分子、不稳定的化合物的分析，但其在速度、灵敏度和便捷方面不如气相色谱法，并且耗费要高出很多。气相色谱法在分析有机磷农药时，是利用不同的有机磷农药在同定相中分离，经不同的检测器检测扫描绘出气相色谱图，通过保留时间来定性，通过峰高或峰面积与标准曲线对照来定量，气相色谱仪的使用条件要求高，对使用环境和操作条件要求严格，使用人员要经过专门的培训，操作繁琐，前左右理比较麻烦，耗时长，没有特定的设备和条件无法实现快速、定量检测。酶抑制法是利用有机磷农药有抑制胆碱酷酶活性的作用，从而影响乙酞胆碱或丁酞胆碱在胆碱酷酶作用下产生胆碱、乙酸或丁酸的反应，使分解产物乙酸或丁酸减少，由此根据指示剂颜色或反应液pH值的变化，达到检测有机磷农药的目的。AOAC在1964年最早公布了该方法检测有机磷农药;美国的中西部研究院于1985年报道的农药检测酶片(Enzyme Ticket)，可测出水中0.1一10 ng /L有机磷(OPS)或氨基甲酸酷类农药;我国农业部环境保护科研监测所李治祥等1989年也做了类似报道。2002年新颁布的中华人民共和国国家标准GB /T18630一2002将酶抑制法作为蔬菜中有机磷及氨基甲酸酷农药残留量的简易检验方法。目前酶抑制法主要有膜电极法和纸片法，具体是将乙酸胆碱(AchE)吸附在载体(电极或纸片)上，遇到有机磷农药时，乙酸胆碱(AchE)活性被抑制，电极的读数指示变化或纸片的颜色变化可定性检测有机磷农药。酶抑制法的优点是操作简便，速度快，不需昂贵的仪器，适合现场检测以及大批样品的筛选检测，不足之左右是精确度低，重复性、回收率还有待提高，并且该法仅限于蔬菜、水果和食品类有机磷农药残留的定性检测，快速、定量的检测还未见有应用。本发明应用酶联免疫法，测定氧化乐果的残留量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，非常容易推广等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于氧化乐果含量测定的酶联免疫试剂盒，其操作简单，适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它包括：

(1)包被有氧化乐果偶联抗原的酶标板；

(2) 氧化乐果标准品溶液；

(3)浓缩酶结合物；

(4)酶结合物稀释液；

(5)底物显色液；

(6)终止液。

所述氧化乐果偶联抗原为氧化乐果半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、鼠血清蛋白、人血清蛋白。

所述氧化乐果半抗原制备过程：

1)取20mg氧化乐果，10ul，1，3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基吡啶溶解于2ml

N，N’-二甲基甲酰胺中，得到I液；

2)取20mg N，N’-二环己基碳二亚胺溶解于0.5mlDMF中，得到II液；

3)在0℃条件下，将II液缓慢滴加至I液中，恢复室温后，继续反应20 h；