[发明专利]生物条形码检测中的NP探针、其制备方法与生物条形码检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的生物条形码检测技术，特别是涉及其中的一种与NP探针联结的单链条形码DNA、新型NP探针、该探针的制备以及基于该新型NP探针形成的生物条形码检测试剂盒，本发明可用于与该单链条形码DNA无核酸序列同源性的病毒抗原的高灵敏度检测。

背景技术

生物条形码检测技术(bio-barcodesassay，BCA)于2003年Mirkin等开发以来，为分子诊断领域，尤其是微量蛋白质检测提供了一个全新的技术平台(NamJM,ThaxtonCS，MirkinCA.Nanoparticle-basedbio-barcodesfortheultrasensitivedetectionofproteins.Science，2003，301(5641):1884-1886)。该技术检测蛋白的原理是利用标记被检物单抗的磁性微球(magneticmicroparticles，MMP)、标记被检物多抗和条形码DNA链的金纳米颗粒(nano-particle，NP)，通过形成MMP-被检物-NP三明治复合物，利用磁场进行分离，洗脱释放NP上标记的条形码DNA链，通过PCR或银染法鉴定就可确定被检物的存在。

BCA技术中，NP探针标记有双链DNA(48bp)和病原的多克隆抗体，双链DNA的其中一条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码DNA，每一个直径为30nm的胶体金上大约标记有400条左右的条形码DNA链(HurstSJ,Lytton-JeanAR,MirkinCA.MaximizingDNAloadingonarangeofgoldnanoparticlesizes.AnalChem,2006,78:8313-8318)；MMP探针是对应于分选磁场的直径约为1μm的磁珠微球，其表面上包被有抗病原的单克隆抗体。BCA技术通过抗原抗体高度特异性反应捕获抗原，再通过检测条形码DNA而实现对被检物的间接检测，由于双链DNA标记的一次放大以及PCR反应和芯片检测的二次放大效应，使检测灵敏度得到极大提高。

发明人所在实验室对传统BCA技术进行了改进，先后建立了用于蓝舌病病毒检测的新型BCA检测技术(YinHQ,JiaMX,YangS,JingPP,WangR,ZhangJG.Developmentofahighlysensitivegoldnanoparticleprobe-basedassayforbluetonguevirusdetection.JournalofVirologicalMethods,2012,183(1):45-48)以及蓖麻毒素检测的新型BCA检测技术(YinHQ,JiaMX,ShiLJ,LiuJ,WangR,LvMM,MaYY,ZhaoX,ZhangJG.Evaluationofanovelultra-sensitivenanoparticleprobe-Basedassayforricindetection.JournalofImmunotoxicology,2013,earlyonline:1-5)，其中蓖麻毒素新型BCA检测方法申报并获得了国家发明专利(ZL201010530075.2,2013-06-19，申请日2010-10-29)。

在上述新型BCA检测技术中，标记的条形码DNA链改进为单链，其长度为90个碱基(如序列表中SEQIDNo：5所示)，其长度适于进行TaqMan探针法的荧光定量PCR检测，但是这一长度的DNA链容易在NP探针表面形成弯曲折叠结构，从而不利于后续基于抗原-抗体反应的NP-被检物-MMP免疫复合物的形成。此外，NP探针制备中，仅采用离心法去除未标记到NP上的游离条形码DNA，这一制备方法不易去除游离条形码DNA，而游离条形码DNA的残留会导致BCA检测的假阳性结果。

发明内容

针对现有BCA检测技术中存在的不足，本发明目的在于改进BCA检测技术，提供一种新型NP探针以及该探针的制备方法。

本发明首先提供一种生物条形码检测中与NP探针联结的单链条形码DNA，所述条形码DNA长度少于90碱基仍适用于荧光定量PCR/TaqMan荧光探针检测的长度，优选为60个碱基。

具体的，该单链条形码DNA核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。

本发明进一步提供一种生物条形码检测中的NP探针，其金纳米颗粒上包被有如上所述的长度少于90碱基的单链条形码DNA。