[发明专利]一种猪凝血酶冻干粉的制备方法

说明书

本发明公开了一种猪凝血酶冻干粉的制备方法，包括以下步骤：抗凝猪血浆与凝胶混合搅拌吸附，过柱洗脱获得凝血酶原溶液；向兔脑粉中加入生理盐水，再加入凝血酶原溶液和CaCl2进行酶原激活，得凝血酶粗酶液，超滤脱盐并浓缩，进行病毒灭活，所得粗酶液过DEAE‑Sepharose Fast Flow层析柱，洗脱收集目的峰，即得猪凝血酶；猪凝血酶加入甘露醇或右旋糖酐40，过滤除菌，分装，冻干，真空压塞，轧铝塑组合盖后，得猪凝血酶冻干品；冻干品在100℃下进行干热处理以再次灭活病毒，包装即得猪凝血酶冻干粉。产品中猪凝血酶比活性不低于130U/mg，整个工艺步骤简单、易实施，提高了制品安全性，适合于工业化生产。

技术领域

本发明涉及猪凝血酶冻干粉的制备工艺，具体涉及一种猪凝血酶冻干粉的制备方法。

背景技术

凝血酶是在血液凝固系统中起重要作用的丝氨酸蛋白水解酶，它能水解血纤维蛋白原的4个Arg-Gly肽键，使溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，促使血液凝固，同时能促使血小板凝集，进一步加速血液凝固，达到迅速止血的目的。

目前临床上使用的凝血酶制剂大部分为从牛血或猪血中提取的凝血酶原，经凝血酶原激活物激活而得凝血酶的无菌冻干品，具有较高的专一性，是一种速效局部止血药，广泛应用于消化道出血和外科手术止血。(宋宏新,马永征,李敏康.凝血酶分离纯化方法的研究进展[J].食品研究与开发,2004,25(6)：65-67.)。

猪凝血酶分子量约为35～39kDa，由两条多肽链通过一个二硫键连接而成，一条链分子量约为34kDa，另一条链分子量约为5kDa；等电点(pI)为5.0～5.5，IEF电泳显示为二条带，pI分别为5.0、5.4(徐长法,王玉仙,刘德富,等.猪凝血酶的分离纯化与鉴定[J].北京联合大学学报,1994,8(1)：44-49.)。猪凝血酶的分离纯化过程大致包括猪血浆的预处理、凝血酶原的提取、凝血酶原的激活及粗凝血酶的制备、凝血酶的纯化等步骤。由于凝血酶制品是从猪血中提取制备而得的多组分生化药品，潜在有猪源性病毒污染的隐患，为提高制品安全性，有必要开展凝血酶病毒灭活工艺研究。

公开号为CN104328101A的中国发明专利公开了一种凝血酶的制备方法，该方法采用病毒灭活试剂灭活处理和纳米滤膜过滤相结合的方式，来灭活和去除制品中潜在的猪源性病毒污染，取得一定的有益效果。但该方法存在①工艺步骤多、复杂，②凝血酶原激活方法复杂、繁琐，③不能避免凝血酶制剂过程中存在外源病毒二次污染风险的缺点。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种猪凝血酶冻干粉的制备方法。

本发明提供的猪凝血酶冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

(1)抗凝猪血浆与经过含有Na2B4O7 3.75mmol/L和H3BO3 85mmol/L且pH值为8.0的硼酸-硼砂缓冲液平衡的QAE-SephadexA50凝胶按照1L:1～1.5g的用量混合，室温搅拌吸附，用双层400目绸布过滤收集吸附有凝血酶原的凝胶，装填层析柱，先用纯化水流洗至基线走平，再用0.1mol/L的NaCl流洗至基线走平，最后用含0.4mol/L的NaCl和2mmol/L的BaCl2的洗脱液洗脱，收集目的峰，获得凝血酶原溶液；