[发明专利]一种猪凝血酶冻干粉的制备方法

权利要求书

1.一种猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)抗凝猪血浆与经过含有Na2B4O73.75mmol/L和H3BO385mmol/L且pH值为8.0的硼酸-硼砂缓冲液平衡的QAE-SephadexA50凝胶按照1L:1～1.5g的用量混合，室温搅拌吸附，用双层400目绸布过滤收集吸附有凝血酶原的凝胶，装填层析柱，先用纯化水流洗至基线走平，再用0.1mol/L的NaCl流洗至基线走平，最后用含0.4mol/L的NaCl和2mmol/L的BaCl2的洗脱液洗脱，收集目的峰，获得凝血酶原溶液；

(2)按兔脑粉与生理盐水为1g∶20mL的比例，向兔脑粉中加入45℃的生理盐水，保持45～50℃搅拌提取15～20分钟后，2000rpm离心5分钟，收集上清液；按照上清液:凝血酶原溶液:CaCl2＝4.7mL:1L:1.4g的用量进行配比混合搅拌均匀后，于25～31℃水浴中静置激活1～2hr进行酶原激活，然后于4℃5000rpm离心10min，用双层400目绸布过滤，收集上清得凝血酶粗酶液；

(3)凝血酶粗酶液用截留分子量8000道尔顿的超滤膜超滤脱盐并浓缩10～20倍，进液压控制在0.15M Pa以内，回流压控制在0.1MPa以内，浓缩后的粗酶液中加入病毒灭活剂搅拌均匀后，于24～26℃下保温6～8hr，进行病毒灭活；所述病毒灭活剂包括终浓度3g/L的磷酸三丁酯和终浓度10g/L的吐温-80；或者所述病毒灭活剂包括终浓度3g/L的磷酸三丁酯和终浓度10g/L的TritonX-100；

(4)灭活病毒后的粗酶液过DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，先用平衡液流洗至基线走平后，用洗脱液洗脱收集目的峰，即得猪凝血酶；

(5)步骤(4)所得猪凝血酶加入终浓度为15～35g/L的甘露醇或右旋糖酐40，过滤除菌，分装，冻干，真空压塞，轧铝塑组合盖后，得猪凝血酶冻干品；

(6)猪凝血酶冻干品在100℃下进行干热处理30～120min以再次灭活病毒，然后进行包装，即得猪凝血酶冻干粉。

2.根据权利要求1所述的猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述平衡液为pH值7.9且浓度为0.02mol/L的PB缓冲液，洗脱液为pH值7.9，且含0.2mol/LNaCl的浓度为0.02mol/L的PB缓冲液。

3.根据权利要求1所述的猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，平衡液为pH值8.0且浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，洗脱液为pH值8.0，且含0.2mol/L NaCl的浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液。

4.根据权利要求1所述的猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，甘露醇或右旋糖酐40的终浓度为25g/L。

5.根据权利要求1所述的猪凝血酶冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，干热处理时间为60min。

6.权利要求1～5任一所述的猪凝血酶冻干粉的制备方法获得的产品。