[发明专利]碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)，即一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法。

背景技术

碱性磷酸酶(NAP)主要存在于成熟中性粒细胞，是一种胞内非特异性水解酶，在碱性条件下能水解多种磷酸酯。随着细胞的成熟，NAP的活性也逐渐增强。在病理情况下，不同疾病及疾病的不同阶段均可引起NAP成分与含量的变化，因此，作为快速测定碱性磷酸酶活性的化学染色法经常被用作各种疾病的临床辅助诊断指标。NAP活性变化对某些疾病的鉴别与诊断具有重要的临床价值：当患有慢性粒细胞白血病时(无继发感染时)，其活性显著减低，缓解期可恢复至正常范围，加速期和急变期时，NAP活性可不同程度增高，该检测可作为观察慢粒白血病疗效和预后的一项指标，也是与类白血病反应鉴别的重要检测项目。急性粒细胞白血病，NAP活性降低，并发感染时可稍增高。NAP活性减低还常见于病毒感染或寄生虫、立克次体感染，恶性组织细胞增生症和淋巴瘤等。至于中性粒细胞碱性磷酸酶活性增高的情况则比较多见，如妊娠16W～20W孕妇，NAP水平显著增高，其他如细菌性炎症、类白血病反应、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、急性淋巴细胞白血病等也伴随有NAP积分增高现象。

碱性磷酸酶的染色方法主要有金属盐沉淀法和偶氮偶联法。

金属盐沉淀法中最经典的是Gomori的钙钴法，其原理是以β-甘油磷酸为底物，在pH9.3的碱性条件下水解为磷酸钠和甘油，磷酸钠与钙离子作用生成磷酸钙，再与钴离子作用生成磷酸钴，后者与硫化铵作用生成不溶性硫化钴沉淀。由于钙钴法存在操作繁琐、费时、有特殊不良气味、硫化铵污染等缺点，目前医疗临床上已经很少应用。

1955年kaplow LS提出了用偶氮偶联法对细胞中的碱性磷酸酶进行染色，其原理是利用碱性磷酸酶在pH9.2-9.8的碱性环境下，水解α-磷酸萘酚钠，产生α-萘酚，后者与重氮剂偶联成有色沉淀物的原理进行染色。但是，α-萘酚为未取代萘酚，与偶氮的有效偶联需要加入过量的重氮盐，对酶活性可能造成阻抑作用，其分解产物对细胞具有非特殊性染色作用，且每次试验需要临时配制孵育液。后期有许多学者找到了α-磷酸萘酚钠盐的替代品，如萘酚AS-BI磷酸钠盐、萘酚AS-MX磷酸钠盐，应用该方法染色具有快速、简便、容易重复等优点，但始终存在阳性染色不明显、显色灵敏度偏低等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)，即一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法，使所述试剂盒以及染色方法应用于血细胞内碱性磷酸酶检测时能够提高阳性染色效果。

本发明的另一个目的在于提供一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法，使所述试剂盒以及染色方法应用于血细胞内碱性磷酸酶检测时能够提高显色灵敏度。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒，包括pH值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。

作为优选，所述N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺浓度为0.125mg/ml～1mg/ml，更优选0.25mg/ml～0.5mg/ml，其分子结构如下：

与传统较常用的底物萘酚AS-BI磷酸钠盐、萘酚AS-MX磷酸钠盐相比，本发明试剂采用的底物在原有发色基团萘甲酰的N位上引入了另一发色基团联苯基，且在联苯基的2位和5位分别用助色基团甲基和甲氧基取代，可以增强碱性磷酸酶水解底物产生的萘酚与偶氮盐反应的显色强度，从而大大提高了碱性磷酸酶的显色灵敏度。

所述碱性磷酸酶底物N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺的合成方法为：以2-羟基-3-萘甲酸(化合物1)和5-甲基-4-苯基邻茴香胺(化合物2)为原料，三氯化磷为羧基和氨基的缩合剂，获得3-羟基-N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-2-萘甲酰胺(化合物3)；再通过五氯化磷磷酸化，最终获得N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺(化合物4)。

合成路线如下：

作为优选，所述碱性磷酸酶底物溶液中还包括基质缓冲液、稳定剂、防腐剂和无机盐。