[发明专利]人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；

其中，所述三维细胞培养支架由骨基质明胶、壳聚糖季铵盐水凝胶和脱细胞软骨匀浆中的至少两种材料制成。

2.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心，取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至1×10⁶～1×10⁸个/25ml，加入所述培养基进行培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1：2～1：3比例接种进行传代培养至细胞生长到融合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，采用三维培养支架进行体外培养的步骤为：取三维培养支架复溶，取第三代骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰个/L细胞浓度与复溶后三维培养支架共同接种于所述培养基中进行培养。

5.根据权利要求4所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，三维培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂。

6.根据权利要求5所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述助溶剂为乙醇，且乙醇的质量分数为5％-15％。

7.根据权利要求3或4所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述培养基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氢化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。

8.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述壳聚糖季铵盐水凝胶的制备过程为：按1:2～1:5的质量比将壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵于70～95℃水浴中反应7～10小时，加入无水乙醇，析出壳聚糖季铵盐，将壳聚糖季铵盐再溶于乙醇中凝胶化，即获得壳聚糖季铵盐水凝胶。

9.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的骨基质明胶和0.2～1g的壳聚糖季铵盐水凝胶组合而成；

或，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的骨基质明胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆组合而成；

或，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的壳聚糖季铵盐水凝胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆组合而成。

10.根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养支架由0.2～1g的骨基质明胶、0.2～1g的壳聚糖季铵盐水凝胶和15-50g/L的脱细胞软骨匀浆组合而成。