[发明专利]一种冷沉淀的预纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及血液制品的制备方法，特别涉及一种冷沉淀的预纯化方法。

背景技术

冷沉淀(cryoprecipitate)是由健康人体血浆分离出来的一种成分血，为均匀的乳白至微黄的呈粘性沉淀，是大规模制备人凝血因子VIII(FVIII)浓缩制剂的原料。目前，国内外普遍采用的FVIII纯化工艺是以冷沉淀为原料，经过初步纯化除去大部分的杂蛋白，利用阴离子凝胶对预纯化料液中蛋白吸附能力的差异去除杂蛋白，得到高纯FVIII成品。

对冷沉淀这种多成分原料来说，预纯化工艺直接影响上样料液(预纯化料液)的质量，后者导致离子交换层析对FVIII的纯化效果和凝胶使用寿命变现出显著性差异。

冷沉淀预纯化方法包括氢氧化铝凝胶吸附、甘氨酸沉淀、聚乙二醇沉淀和酸性沉淀，已经将它们的组合，但是纯化效果均不佳。

如，罗亮等，“离子交换层析法制备人高纯FVIII制剂”，华西药学杂志2000,15(3)∶174～176公开了一种预纯化方法，具体是先将冷沉淀用肝素钠水溶液溶解，再经氢氧化铝吸附、酸沉淀和聚乙二醇沉淀处理，采用该方法纯化，FVIII的比活仅提高了1.85倍(0.61/0.33，详见表5)，且需要采用肝素钠进行前处理，涉及多次升温和降温过程，操作复杂，成本高。

邓志华等，“人凝血因子VIII提取工艺优化研究”，江西医药2014年2月第49卷第2期公开了一种预纯化方法，具体是先将冷沉淀用肝素钠水溶液溶解，再经氢氧化铝吸附、酸沉淀处理，采用该方法纯化，FVIII的比活最高也仅提高了1.9倍，且需要采用肝素钠进行前处理，涉及多次升温和降温过程，再者其需制备氢氧化铝胶，操作复杂，成本高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新冷沉淀预纯化方法。

本发明冷沉淀的预纯化方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)取冷沉淀，溶解；

(2)加入氢氧化铝凝胶干粉，氢氧化铝凝胶干粉的用量为冷沉淀的5～30％w/w，搅拌15～30min；

(3)再加入聚乙二醇至终浓度为3.0～4.0％w/v，混匀，调pH为6.0～6.5，继续搅拌15～60分钟；

(4)离心，离心的时间是10～30min，得上清，滤膜过滤，即可。

步骤(1)中，冷沉淀溶解于20mmol/L、pH6.8的Tris溶液中。

优选地，溶液的步骤是：在搅拌条件下，将冷沉淀加入Tris溶液中，其中，搅拌的频率是80～120rpm。

步骤(1)中，溶解时的温度不低于20℃。

步骤(2)中，所述氢氧化铝凝胶干粉的用量为冷沉淀的5～15％w/w。

步骤(2)中，所述搅拌时间为15～20分钟。

步骤(3)中，聚乙二醇是通过加入聚乙二醇母液的方式加入，其中，聚乙二醇母液中含有30％w/v的聚乙二醇和0.21％w/v的枸橼酸钠，且其pH为6.3。

步骤(3)中，所述搅拌时间为20～40分钟。

步骤(2)和步骤(3)中，所述搅拌的频率是80～120rpm。

步骤(4)中，所述离心的时间是15～20分钟。

步骤(4)中，离心机的转速为3500～4200rpm。

步骤(2)～(4)期间，控制温度为20～37℃。

所述温度为25～35℃。

本发明还提供了前述的方法制备的预纯化液。

本发明还提供了前述预纯化液在制备人凝血因子VIII制剂中的用途。

本发明预纯化方法的纯化效果好，FVIII的比活提高了3.69～5.64倍，而且操作简单，无需反复调整温度，只需一步离心即可实现杂蛋白和FVIII料液的有效分离，减少劳动强度和设备投入；沉淀剂均为药用级原料药，减少了自行配制过程中质量的不稳定和不安全性，易于操作，质量可控。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1本发明冷沉淀的预纯化方法

⑴取冷沉淀25kg

冷沉淀指来源于-20℃以下保存不超过1年的健康人血浆；