[发明专利]一种硫酸盐还原菌的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及硫酸盐还原菌的定性或定量检测，尤其涉及用于检测硫酸盐还原菌分子的特异性引物对、应用该引物对定量检测硫酸盐还原菌的检测方法以及检测试剂盒，属于硫酸盐还原菌的检测领域。

背景技术

硫酸盐还原菌于1895年首先由Beijerinck发现，至今已有百年历史。据不完全统计，硫酸盐还原菌已有59个属近100个种，D.desulfuricans(脱硫弧菌)是最一般的活动细菌。

硫酸盐还原菌普遍生长在土壤、河水、海水中，并发现在地下71米的粘土及水深3000米的海底中也有这类细菌生存，鉴别特征：单细胞，无色，无芽孢，具弯轴(非螺旋状)的杆状有机体，宽度小于2微米，以单根鞭毛运动，革兰氏阴性、厌氧、异养，在广泛利用有机物的同时，把硫酸盐、亚硫酸盐、硫、硫代硫酸盐和连二亚硫酸盐还原成H₂S，并且不沉积铁的氧化物，沉积FeS。

在油田中，硫酸盐还原菌产生的H₂S对注采设备及集输管道具有极强的腐蚀性。经硫酸盐还原菌的腐蚀，输油管路容易出现漏油、跑油的问题，严重时引发爆炸等安全事故；硫酸盐还原菌腐蚀也是造成井口装置失灵，闸门丝杆断裂，油套管穿孔的主要原因；另外，硫酸盐还原菌的腐蚀产物中有Fe₂S等存在，导致水质恶化，水变黑、发臭，直接影响原油质量。

因此研制一种广谱快速灵敏的硫酸盐还原菌检测方法，实时检测油田水质中硫酸盐还原菌的含量，对腐蚀情况进行分析，适时采取防腐措施，在保障油田正常生产运行，延长金属设备的使用寿命，保护地层地面水质环境方面具有重要的现实意义。

目前使用的硫酸盐还原菌检测方法主要包括以下3种方法：(1)直接镜检法，该方法较为直观，但是准确性低，就算专业人士难以辨认出所有硫酸还原菌；(2)基于可培养技术的检测方法，具体包括液体培养方法(测试瓶法)和固体培养方法：液体培养法是将待测样品进行梯度稀释，根据培养液性状结合最大概率数法(MPN法)确定细菌浓度；固体培养方法，用硫酸盐还原菌选择性固体培养基筛选分离硫酸盐还原菌，根据菌落数确定细菌浓度。这些方法操作较为简捷，但耗时过长，一般需要7天，而且检测的准确性和灵敏度不高，依赖于硫酸盐还原菌的可培养技术，难以检出所有硫酸盐还原菌。(3)基于分子生物学的硫酸盐还原菌检测方法，即检测检测硫酸盐还原菌的特定基因确定细菌含量，具体方法，主要有PCR、PCR-RFLP和原位杂交，常用的遗传标记主要有SRB16S rRNA基因的特征序列、亚硫酸盐异化酶基因和APS基因等。该方法快速、灵敏针对特定的硫酸盐还原菌特异性高，但是，检测成本高、目前只能针对某种硫酸盐还原菌进行检测，没有研制出一种广谱的硫酸盐还原菌检测方法。

因此，克服传统可培养技术检测方法的各种缺陷，不需要提取DNA也不需要进行长时间的细菌培养，建立一种检测快、成本低、灵敏度高、广谱性好的的硫酸盐还原菌检测方法显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一对灵敏度高、特异性强、广谱性好的检测硫酸盐还原菌的引物对。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种快速、灵敏、准确且具有广谱性的定量检测硫酸盐还原菌的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明首先公开了用于检测硫酸盐还原菌的特异性的引物对，引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的反向引物组成；其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T。

上述引物对的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列包括引物序列的互补链序列，同时还可以向5'端和3'端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

利用本发明设计的特异性引物对扩增硫酸盐还原菌特征基因，确定所需DNA模板浓度下限值，结果表明25μL体系需要细菌DNA模板量下限为4ng，表明本发明提供的特异性引物对扩增硫酸盐还原菌特征基因具有高度灵敏性。