[发明专利]一种硫酸盐还原菌的分子检测方法

权利要求书

1.用于检测硫酸盐还原菌的引物对，其特征在于：所述引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的反向引物组成；其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T。

2.权利要求1所述的引物对在定性或定量检测硫酸盐还原菌中的应用。

3.一种硫酸盐还原菌的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)建立硫酸盐还原菌定量检测标准曲线和线性方程；(2)预处理样品；(3)以预处理后的样品为模板，利用权利要求1所述的引物对建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(4)琼脂糖凝胶电泳检测；(5)利用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，得到条带亮度相对值，查标准曲线和线性方程定量确定硫酸盐还原菌浓度。

4.按照权利要求3所述的定量检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述硫酸盐还原菌定量检测标准曲线和线性方程是按照以下方法建立：(a)预处理样品；(b)将预处理后的样品进行最大稀释度梯度稀释；(c)以稀释后的样品为模板，利用权利要求1所述的引物对建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(d)琼脂糖凝胶电泳检测；(e)利用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，检测每个条带亮度值，设定最大稀释梯度样品检出的亮度值为1，得到各浓度硫酸盐还原菌亮度值的相对值，根据各硫酸盐还原菌浓度与其亮度值相对值之间的关系建立标准曲线和线性方程。

5.按照权利要求4所述的定量检测方法，其特征在于：步骤(e)中所述标准曲线和线性方程的建立是按照以下方法建立：利用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，检测每个条带亮度值，设定最大稀释度样品检出的亮度值为1，得到各浓度硫酸盐还原菌亮度值的相对值，以硫酸盐还原菌的浓度值为横坐标，亮度相对值为纵坐标，建立标准曲线和线性方程。

6.按照权利要求5所述的定量检测方法，其特征在于：设定菌浓度为10个/ml的亮度值为1，以硫酸盐还原菌的浓度值：8000个/ml、6000个/ml、4000个/ml、2000个/ml、1000个/ml、100个/ml为横坐标，以各浓度对应的亮度相对值：21.944、18.452、14.17、10.83、7.87、5.937为纵坐标，建立标准曲线和线性方程。

7.按照权利要求3或4所述的定量检测方法，其特征在于，所述预处理样品包括以下步骤：(Ⅰ)取待测水样，过滤，除掉杂质；(Ⅱ)取滤液1ml于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，倒掉上清液体；(Ⅲ)加入100μL溶菌酶37℃处理半小时；(Ⅳ)12000rpm离心10min，用枪头吸掉上清溶菌酶液体，于离心管中加入500μL蒸馏水，重新悬浮破壁菌体，12000rpm离心10min，倒掉上清液体，留下底部破壁菌体；(Ⅴ)加入11.5μL蒸馏水再次悬浮破壁菌体，将离心管置于沸水中煮5min，即得。

8.按照权利要求3或4所述的定量检测方法，其特征在于：所述的PCR反应体系为25μl：样品11.5μl，2×EasyTaq SuperMix 12.5μl，10μM正反向引物各0.5μl；所述的PCR扩增的反应程序为：阶段一：95℃3min；阶段二：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃1min，35个循环；阶段三：72℃，10min；所述琼脂糖凝胶电泳检测的缓冲液为0.5×TBE，染料为Gel-red，上样量为2μl。

9.一种硫酸盐还原菌的检测试剂盒，包括：2×EasyTaq SuperMix，扩增引物对，其特征在于：所述扩增引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的反向引物组成，其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T。