[发明专利]骨髓间充质干细胞的诱导方法及其诱导液

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种骨髓间充质干细胞的诱导方法以及所使用的诱导液。

背景技术

冠心病心肌梗死及心力衰竭是严重影响人民生活质量和寿命的主要疾病之一。研究资料显示，成熟的心肌细胞缺乏再生能力，心肌梗死(MI)发生后，梗死区心肌只能通过纤维组织增生，由无收缩功能的疤痕组织代替，导致心功能下降。临床上缺乏针对梗死心肌再生、重建的根本性治疗方法，而细胞替代治疗应运而生成为一个理想的治疗策略。

骨髓间充质干细胞(Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势，因此，探讨MSCs体外大量扩增及向心肌细胞诱导分化条件将对损伤心肌的修复治疗具有深远意义。

在研究MSCs向心肌细胞分化诱导中，目前主要使用化学诱导剂5-氮胞苷(5-azacytidine，5-AZA)。5-AZA是胞苷的类似物，它可以与DNA共价结合形成复合物从而导致DNA甲基在细胞分裂周期中进行性丢失，发挥去甲基化作用，启动MyoD等某些相关等位基因的表达。国外有学者将成年小鼠骨髓基质细胞经5-氮胞苷诱导后，能产生自主收缩的肌管结构的细胞团，显微镜下结构类似胚胎心肌细胞。但细胞经过5-AZA处理后可导致细胞部分皱缩，脱壁，降解、或胞浆内形成脂肪空泡，说明5-AZA作为一种诱导剂对细胞也有一定毒性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中骨髓间充质干细胞诱导转化为心肌细胞的方法所获得的心肌细胞存在细胞易皱缩脱壁死亡等缺陷，提供一种能够提高骨髓间充质干细胞的活性及转化率的骨髓间充质干细胞的诱导方法及该方法中所使用的诱导液。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种骨髓间充质干细胞的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取骨髓间充质干细胞进行体外培养；

在体外培养过程中用诱导液进行诱导；

其中，所述诱导液包括血管紧张素II和骨形态发生蛋白-2。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，所述血管紧张素II的浓度为1-5μmol/L，骨形态发生蛋白-2的浓度为50-200μg/L。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，获取骨髓间充质干细胞的方法步骤包括：

抽取人骨髓，在含有低糖DMEM的离心管中混合，再过筛，得到细胞悬液，再将所述细胞悬液加入到含Percoll分层液的离心管中，离心，获取单个核细胞。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，所述Percoll分层液的密度为1.067-1.082kg/L。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，获取骨髓间充质干细胞的方法步骤还包括：在获取单个核细胞后，用含有胎牛血清、青霉素和/或链霉素的DMEM对单个核细胞进行培养，再于CO₂培养箱中孵育，36-96个小时后更换培养基，除去未贴壁的细胞，以后每2-4天换液1次，直到单个核细胞增殖达到融合状态，即获得纯化后的原代骨髓间充质干细胞。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，所述DMEM培养基中，胎牛血清的浓度为180-120mg/L，青霉素的浓度为90-110ug/ml，和/或链霉素的浓度为90-110ug/ml。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，用所述诱导液进行诱导反应之前，还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：

S21、用1.5～3mL/L胰蛋白酶将原代骨髓间充质干细胞消化分离，再用完全培养基中止消化，制成细胞悬液；然后传代接种于含新生牛血清的DMEM培养瓶中培养，隔1～3天换液，直至细胞达到90％以上融合；

S22、重复步骤S21继续传代至第4代骨髓间充质干细胞后，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，再用PBS冲洗后，以0.5～1.5×10⁵个/ml的密度接种于多孔板上，培养2-5天。

在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，用所述诱导液对第4代骨髓间充质干细胞进行诱导反应，包括以下步骤：

利用所述诱导液诱导分化12-36个小时，吸弃诱导液，再用PBS清洗3次，继续用完全培养基培养，每2-5天换液一次，继续培养1-4周。