[发明专利]一种微量热法结合测定自由基清除率确定高抗氧化大豆肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于大豆深加工技术领域，尤其是一种微量热法结合测定自由基清除率确定高抗氧化大豆肽的制备方法。

背景技术

蛋白质的酶法改性通常是指利用酶水解对大豆蛋白进行改性。蛋白质的酶法改性因专一性强、酶解过程温和，而受到人们的广泛关注。随着酶生产、膜反应器和固定化酶技术的不断发展，酶水解方法更趋于简单化、自动化，酶法水解已成为新的方向。随着一些新用途的酶的发现和应用，极大的拓宽了酶法改性的应用范围，例如各类蛋白水解酶、转谷氨酰胺酶、磷酸酶以及过氧化氢酶的应用，使得过去只能采用化学方法进行的磷酸化、去酰胺、交联聚合等改性方式都可以采用酶法改性来进行。特别是一些低廉价格的微生物酶的出现，进一步降低了酶法改性的成本，使其更具有实用性。

伴随着酶化学的迅猛发展，美国、日本对于大豆蛋白的酶解工艺和酶解过程的感官特性、功能特性及营养价值改善的研究取得了较大的进展。目前国内外生产的大豆肽是大豆蛋白质经蛋白酶水解得到的多种肽分子混合物。

对蛋白酶水解制备大豆肽的方法国内外学者进行了大量的研究,大都是通过测定产物的性质，来确定最佳反应温度、酸度等条件,试验方法较复杂，随意性较大，不能准确定量确定蛋白酶水解反应的最佳工艺。致使蛋白酶水解工艺控制欠缺理论指导,控制难。微量热法通过高灵敏度的微量量热仪直接测量酶催化反应过程中微量的热量变化，获得蛋白酶对大豆蛋白催化反应的热功率—时间曲线，定量确定蛋白酶水解大豆分离蛋白最佳反应温度、pH。具有灵敏度高、操作简单等优点。结合测定自由基清除率可以准确定量确定高抗氧化大豆肽的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供一种制备高抗氧化大豆肽的方法。本发明用一种新的研究方法微量热法,对大豆蛋白酶解制取大豆肽最适蛋白酶、最适条件进行定量的研究，结合测定产物自由基清除率确定一种新的高抗氧化大豆肽的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种微量热法结合测定自由基清除率确定高抗氧化大豆肽的制备方法,其特征在于,具体方法包括以下步骤:

(1)配制溶液：

溶液①：准确称取大豆分离蛋白样品，用不同pH值(pH3.3-pH10.0)的缓冲溶液分别配制浓度为5-10gL^-1的大豆分离蛋白溶液。

溶液②：配制浓度为0.1-0.3gL^-1的中性蛋白酶(酶活力5.3×10⁴U/g)溶液，胰蛋白酶(酶活力5.1×10⁴U/g)溶液，菠萝蛋白酶(酶活力6.0×10⁴U/g)溶液，碱性蛋白酶(酶活力5.7×10⁴U/g)溶液。

(2)90℃大豆分离蛋白溶液进行水浴处理10min；

(3)测定热功率时间曲线:取溶液①2ml放入不锈钢安瓿中。把滴定微量量热仪的连杆上绕细塑料管，管中盛蛋白酶溶液②1ml，先预热，当温度恒定后，将搅拌系统打下，转速为60-120rpm，用蠕动泵把蛋白酶溶液②注入安瓿中，然后进行热功率—时间曲线的测定；

(4)通过热功率—时间曲线，按照热动力学理论和对比进度法解析出中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶各温度(306.15K-336.15K)、pH值(pH6.13-pH9.22)时米凯利斯常数Km和最大速度Vmax，并建立米凯利斯常数与温度、pH值间的关系式，从而获得中性蛋白酶最适温度319.19K﹑最适pH7.13；胰蛋白酶最适温度323.27K﹑最适pH7.77；菠萝蛋白酶最适温度314.63K﹑最适pH6.99；碱性蛋白酶最适温度329.5K﹑最适pH8.25。

(5)通过热功率—时间曲线，求得中性蛋白酶在其最适温度﹑最适pH的米凯利斯常数Km＝24.02g·L^-1,胰蛋白酶在其最适温度﹑最适pH的米凯利斯常数Km＝42.41g·L^-1,菠萝蛋白酶在其最适温度﹑最适pH的米凯利斯常数Km＝50.31g·L^-1,碱性蛋白酶在其最适温度﹑最适pH的米凯利斯常数Km＝16.01g·L^-1,从而可以知道碱性蛋白酶与底物大豆分离蛋白的亲和力最强，结合产物自由基清除率测定进一步确定碱性蛋白酶是催化水解大豆分离蛋白的最适蛋白酶。