[发明专利]一种快速、高通量提取植物基因组DNA的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速、高通量提取适用于PCR扩增的植物基因组DNA的提取方法，并进一步公开其应用。

背景技术

基因组DNA作为遗传信息的载体和最基本的遗传物质，在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程的主要研究对象。植物基因组DNA被用来作为PCR反应的模板进行基因克隆、定位、分子标记辅助育种、转基因材料检测等研究。无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的DNA。因此，提取出足够量的高质量的DNA是获得准确实验结果的前提和必要保障。

植物基因组DNA提取的方法有很多，基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。不同植物的基因组DNA提取方法有所不同；不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及成分不同，分离方法也有差异。

常用的植物基因组提取方法主要包括SDS法和CTAB法两种，但植物细胞内不仅具有很高的核酸酶活性，而且其细胞壁含有大量的多糖，且其组成因物种不同而各异。这些多糖对植物基因组DNA的提取过程中的共沉淀步骤造成了影响，降低了核酸的纯度。使得这两种传统方法提取过程繁琐、耗时耗力，冗长的提取过程不仅增加了基因组DNA被污染的可能，影响了其纯度，还可能降低了活性，丧失其天然特性；同时由于频繁的使用多种有毒有害的有机溶剂，产生大量的有毒废液，因此已被大多数实验室摒弃。

随之兴起的试剂盒法是根据核酸分子量的差异或利用特异性膜对DNA的特异性吸附而实现对DNA的分离，它的出现在一定程度上减轻了科研人员的负担，适用于少量高纯度植物基因组DNA的提取，但其操作过程也过于繁琐，且价格昂贵，不适用于群体遗传学、分子标记辅助育种、转基因植株筛选等需要大规模基因组提取的实验。因此，迄今为止，还没有形成快速、简便的植物基因组DNA提取的技术方法。

中国专利CN102839167A公开了一种简易快速高通量提取植物基因组DNA的方法，该方法通过优化DNA提取液的配方，利用三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl(pH8.0)、乙二胺四乙酸(EDTA)和氯化钾的自配试剂配方，在不使用酶试剂且无需液氮研磨的情况下完成DNA组的提取，不仅操作简单且成本低。一次可以高通量处理384个样品，且提取过程仅需2.5小时，耗时短。所提DNA仅需0.5微升为PCR模板，纯度高且清洁无污染。该方法可广泛应用于植物群体遗传学、系统进化、分子标记辅助育种和深度测序等研究，适于产业化生产和普通生物实验室科学研究。但是，其提取过程依然较为繁琐，也依然存在提取时间较长的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于现有技术中提取植物基因组DNA的方法提取过程繁琐、耗时耗力的技术问题，进而提供一种可快速、高通量提取适用于PCR扩增的植物基因组DNA的提取方法，并进一步公开其应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的快速、高通量提取植物基因组DNA的方法，包括如下步骤：

(1)取待提取的植物组织加入SDS提取液混匀，并充分研磨；所述SDS提取液配方为：80-120mMTris·HCl，40-60mMEDTA，80-120mMNaCl，0.5-1.5％w/vSDS，pH8.0；

(2)将研磨后的样品于60-70℃加热5～10min，并于室温下高速离心处理；随后吸取样品上清液，并加入等体积的异丙醇混匀，室温下静置处理；

(3)将静置处理后的样品再次高速离心处理，并除去上清液，随后加入质量浓度不低于70％的乙醇，充分混匀；

(4)将混合后的样品再次高速离心处理，完全弃去上清液后，将所述样品干燥处理；

(5)向干燥后的样品中加入双蒸水，于35-40℃温度下静置，并常规保存，即得所需的植物基因组DNA作为模板进行后续的PCR反应。

优选的，所述步骤(1)中，所述SDS提取液配方为：100mMTris·HCl，50mMEDTA，100mMNaCl，1％w/vSDS，pH8.0。

所述步骤(1)中，所述植物组织的质量与所述SDS提取液的体积比为1∶0.2-0.5，其中，所述质量与体积的比例单位为g/mL。

优选的，所述植物组织的质量与所述SDS提取液的体积比为1∶0.3。

所述步骤(2)、(3)和(4)中，所述高速离心步骤的转速彼此独立的为10000-12000rpm，并离心处理8-15min。