[发明专利]一种基于链置换放大和DNAzyme放大的检测DNA甲基转移酶活性的方法

说明书

本发明涉及一种基于链置换放大和DNAzyme放大的检测DNA甲基转移酶活性的方法。设计一种三功能双链DNA探针，利用DNA甲基转移酶特异性地识别该三功能双链DNA探针发生甲基化，HpaII限制性内切酶特异性地切割残余的未甲基化的双链DNA，甲基化的双链DNA引发链置换反应，释放大量的8–17DNAzyme，8–17DNAzyme催化大量发夹型分子信标底物的切割，引发显著的荧光增强。本发明所述方法可灵敏检测DNA甲基转移酶活性，检测限为0.0082U/mL，并且该方法在研究抗癌药物对DNA甲基转移酶活性的抑制影响和筛选DNA甲基转移酶抑制剂方面具有潜在的应用。

技术领域

本发明涉及酶的检测领域，具体涉及一种基于链置换放大和DNAzyme放大的检测DNA甲基转移酶活性的方法。

背景技术

DNA甲基转移酶催化DNA甲基化，在调节基因表达和发育方面起关键作用。异常的DNA甲基转移酶活性导致异常的DNA甲基化，这与许多类型的疾病如癌症密切相关。显然，DNA甲基转移酶活性被认为是一种潜在的癌症生物标志物和癌症治疗中的药物作用靶点。因此，发展一种灵敏、选择性的方法用于DNA甲基转移酶活性的分析和其抑制剂(抗甲基化药物)的筛选对于早期癌症诊断和治疗至关重要。

用于DNA甲基转移酶活性检测的传统方法包括凝胶电泳、高效液相色谱和放射性标记法。尽管这些方法已经很好的建立，但大多数存在耗时、费力或需要放射性试剂等缺点。为了克服这些缺陷，现有技术开发了新的方法包括荧光、比色、化学发光和电化学方法用于DNA甲基转移酶活性检测。在这些方法中，荧光方法由于简单、灵敏的特点受到广泛的关注。除了基于碳纳米材料的异相方法，目前建立了许多荧光方法用于均相分析检测DNA甲基转移酶活性。Li Jun等发展了一种基于发夹荧光DNA探针的简单荧光方法，然而，由于目标物和信号比为1:1，该方法的灵敏度相对较低，检测限为0.8 U/mL。为了提高检测灵敏度，许多信号放大策略包括DNAzyme放大、切割酶辅助的DNA循环反应和外切酶III辅助的DNA循环反应，被应用于DNA甲基转移酶活性的检测分析中。相比于发夹荧光DNA探针为基础的方法，这些方法的灵敏度提高了约一个数量级。然而为了满足生物研究和临床诊断的发展需求，灵敏度需要进一步的改善。因此，仍然迫切需要发展一种灵敏的策略方法用于分析DNA甲基转移酶活性。

发明内容

为解决现有技术中的上述问题，基于链置换放大和DNAzyme放大，发明人通过研究，提供了一种双放大荧光策略用于灵敏检测DNA甲基转移酶活性。具体为：设计一种三功能双链DNA(dsDNA)探针，包括用于DNA甲基转移酶识别的甲基化位点、用于合成DNAzyme的8–17 DNAzyme互补序列、用于切割酶切割的切割位点。首先，DNA甲基转移酶特异性地识别和催化该三功能双链探针发生甲基化，形成甲基化的dsDNA。随后，HpaII限制性内切酶特异性地切割残余的未甲基化的dsDNA。接下来，甲基化的dsDNA触发链置换放大和DNAzyme放大反应，实现双放大。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

1、一种检测DNA甲基转移酶活性的方法，其特征在于，通过链置换反应放大和DNAzyme放大DNA甲基转移酶的识别信号；DNA甲基转移酶的作用使得限制性内切酶无法切割探针序列，探针序列通过切割酶依赖的链置换反应扩增出DNAzyme，进行信号一级放大；DNAzyme催化分子信标裂分释放荧光信号，并重新释放DNAzyme，进行信号的二级放大；缺少DNA甲基转移酶时，探针序列被限制性内切酶切割，无法进行切割酶依赖的链置换反应。

具体的，所述方法包括如下步骤：

(1)制备用于进行链置换反应的三功能双链DNA(dsDNA)探针，探针包括杂交双链部分和悬垂单链部分，杂交双链部分含有DNA甲基转移酶识别位点，和包含该位点的限制性内切酶的识别位点，垂悬单链部分包括链置换反应切割酶识别的切割位点、用于合成DNAzyme的DNAzyme互补序列；