[发明专利]一种基于链置换放大和DNAzyme放大的检测DNA甲基转移酶活性的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断治疗目的的检测DNA甲基转移酶活性的方法，通过链置换反应放大和8-17 DNAzyme放大DNA甲基转移酶的识别信号；DNA甲基转移酶的作用使得限制性内切酶无法切割探针序列，探针序列通过切割酶依赖的链置换反应扩增出8-17 DNAzyme，进行信号一级放大；8-17 DNAzyme催化分子信标裂分释放荧光信号，并重新释放8-17 DNAzyme，进行信号的二级放大；缺少DNA甲基转移酶时，探针序列被限制性内切酶切割，无法进行切割酶依赖的链置换反应，其特征在于所用DNA探针为三功能双链DNA探针，包含用于合成8-17DNAzyme的原料8-17 DNAzyme，检测过程包括如下步骤：

(1)制备用于进行链置换反应的三功能双链DNA探针，探针包括杂交双链部分和悬垂单链部分，杂交双链部分含有DNA甲基转移酶识别位点，和包含该位点的限制性内切酶的识别位点，垂悬单链部分包括链置换反应切割酶识别的切割位点、用于合成8-17 DNAzyme的8-17 DNAzyme互补序列；所述三功能双链DNA探针由两条单链P1和P2退火形成，P1序列对应三功能双链DNA探针的杂交双链部分序列，P1为包括DNA甲基转移酶识别位点的单链，DNA甲基转移酶识别位点区域可被限制性内切酶识别，P2序列按3′-5′顺序依次为P1互补序列、链置换反应切割酶识别的切割位点、用于合成8-17 DNAzyme的8-17 DNAzyme互补序列；

(2)加入步骤(1)探针所对应的DNA甲基转移酶孵育，然后加入步骤(1)探针所对应的限制性内切酶进行反应；

(3)对步骤(2)反应获得体系进行酶灭活，然后进行切割酶依赖的链置换反应，扩增8-17 DNAzyme；

(4)加入8-17 DNAzyme识别的分子信标，进行信号检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，三功能双链DNA探针的杂交双链部分中P1的DNA甲基转移酶识别位点与3’端间的区域为2-7个碱基的抑制区域。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抑制区域的碱基为5个。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分子信标为具有茎环结构的分子信标，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，与8-17 DNAzyme杂交，从而引发自身二级裂分，释放荧光信号。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，P1序列为SEQ ID NO:1所示，P2序列为SEQID NO:2所示，DNA甲基转移酶为M.SssI，所对应的限制性内切酶为HpaII。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，分子信标的序列为SEQ ID NO:4所示。

7.一种利用权利要求1-6任一项所述方法进行DNA甲基化转移酶抑制剂/拮抗剂筛选的方法，其特征在于：在步骤(2)中，在加入DNA甲基化转移酶之前，加入不同浓度的候选抑制剂，进行孵育。