[发明专利]一种乳腺癌干细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种乳腺癌干细胞的培养方法。

背景技术

乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。在我国，乳腺癌的发病呈明显上升趋势，目前已成为女性最常见的恶性肿瘤。有学者认为肿瘤干细胞的存在是恶性肿瘤的根源所在。多年的治疗研究显示，乳腺癌干细胞在放疗中的抗药性和药物排除能力、化疗过程中的抵御辐射等行为以及术后的复发和转移仍是其治疗方面较棘手的问题。因此，亟需研发出合适的筛选方法以有效筛选出乳腺癌干细胞，从而用以乳腺癌发病机制和生物治疗等方面的研究。

现有技术主要采用流式细胞仪分选或免疫磁珠分选的方法分离乳腺癌肿瘤干细胞，其成本较高，流程繁琐，而且获得的细胞活力差，后续培养及研究难度大。

研究表明，CD44⁺CD24^-是致瘤性乳腺癌干细胞最基本的表型标记，此类细胞亚群在乳腺癌中起着干细胞样作用，与乳腺癌侵袭、归巢和转移密切相关。因此，开发以乳腺癌干细胞为靶点的新一代抗肿瘤生物及免疫药物成为了根治乳腺癌的发展方向之一。然而，由于乳腺癌干细胞在乳腺癌组织中的比例只有1％左右，因此如何分离获得有效的乳腺癌干细胞，并在体外进行大规模扩增培养，建立乳腺癌干细胞系，成为了乳腺癌干细胞技术发展的瓶颈。

三维细胞培养技术是将细胞种植在一定的细胞外基质中，细胞外基质充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构。在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域，三维细胞培养技术得到了广泛的应用。许多研究发现，体外三维的培养环境比二维的培养环境更有利于细胞功能的保持和发挥。研究表明，三维细胞培养系统能够有效地促进造血干细胞的活性，在无细胞因子存在时仍能够保持造血干细胞长期存活增加细胞数量，增强细胞分裂能力。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种乳腺癌干细胞的培养方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种乳腺癌干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将获得单细胞状态的人乳腺癌细胞，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，制成细胞悬液；

S2、取对数生长期细胞悬液加入适量鲑鱼凝血酶，使凝血酶的浓度为1～4U/mL，混合均匀后，等体积加入浓度为1.5～3mg/mL的鲑鱼胶原蛋白原，得混合液；

S3、按5×10³～5×10⁴个/mL的密度将混合液接种于超低粘附力的BME的96孔板内，36～38℃下保温，使其凝固成软凝胶；

S4、在软凝胶上方加入体积为混合液1～2倍的DMEM/F12培养液、1×B-27、25～75ng/ml的上皮生长因子、10～30ng/ml成纤维细胞生长因子、50ng/ml的胰岛素样生长因子-1和0.4-0.6ng/ml氢化可的松中培养7天，得乳腺癌干细胞微球。

其中，所述步骤S4中的培养条件为：温度37℃，5％CO2，且每周更换培养基2-3次。

其中，所述浓度为1.5～3mg/mL的鲑鱼胶原蛋白原采用完全培养基和鲑鱼胶原蛋白原配制。

其中，所述完全培养基为添加有9～16v/v％胎牛血清、82～158U/ml青霉素和82～158mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。

本发明具有以下有益效果：

利用BME使乳腺癌干细胞之间没有任何接触，并且加入促干细胞生长的因子，使干细胞的分离更加稳定，并实现有效扩增；采用水凝胶对人乳腺癌细胞进行三维培养，直接获得乳腺癌干细胞微球，所得微球细胞为ESA⁺CD44⁺/CD24^-/low表型，明显具有肿瘤干细胞的特性。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中的培养条件为：温度37℃，5％CO2，且每周更换培养基2-3次。

所使用的浓度为1.5～3mg/mL的鲑鱼胶原蛋白原采用完全培养基和鲑鱼胶原蛋白原配制，其完全培养基为添加有9～16v/v％胎牛血清、82～158U/ml青霉素和82～158mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基。

实施例1