[发明专利]一种金属螯合纳米介质及制备方法和应用于强化包涵体蛋白复性与集成纯化的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中的蛋白质复性和分离技术；涉及一种金属螯合纳米介质及制备方法和应用于强化包涵体蛋白复性与集成纯化的方法。

背景技术

基因工程技术的飞速发展，使得基因工程药物的大规模生产成为可能。此类药物的生产需要适宜的重组基因表达系统，细菌表达系统表达目标蛋白具有快速、大量、廉价的优点，但是外源蛋白的过量表达经常形成蛋白的聚集体，即包涵体。包涵体不具有生物学活性，需要重新折叠复性才能恢复其天然结构和生物活性。复性过程中折叠中间体之间疏水作用导致的聚集是降低复性收率的重要原因，因此，抑制聚集是促进复性的关键。与此同时，复性之后的包涵体蛋白很难得到高效的分离纯化，这也是限制其大规模生产的重要环节。

复性体系中加入抑制蛋白质聚集的小分子添加剂，如低浓度的变性剂，精氨酸，人工分子伴侣，甘油等，能够有效促进蛋白质复性。但是添加剂的使用会在复性体系中引入新的杂质，不利于后期目标蛋白的分离纯化；并且许多复性添加剂在抑制分子间聚集的同时，也会抑制蛋白质的分子内折叠，造成复性速率降低。色谱复性的方法不仅可以有效抑制蛋白质的聚集，在复性的同时还对蛋白质有一定的分离纯化效果。但是介质与蛋白质分子间的吸附作用会导致色谱复性达到平衡的时间延长，速率降低；并且回收产品的浓度较低。

为了克服小分子添加剂辅助复性和色谱复性技术的不足，有申请人提出同电荷的荷电物质抑制蛋白质聚集、促进蛋白质复性的方法(离子交换色谱介质辅助蛋白质复性的方法及应用，CN101948504A，2011)。与传统复性方法相比，同电荷介质促进蛋白质复性的方法既不会对目标蛋白质造成污染，也不会降低蛋白质的折叠速率，并且操作简单、介质易于回收，无需昂贵的大型设备。目前复性研究中用到的同电荷介质主要包括多孔的琼脂糖凝胶介质、无孔的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球介质以及纳米粒子等。其中无孔微球介质由于比表面积有限，电荷修饰密度较低(300μmol/g)，限制了其辅助复性的效果，需要通过二次修饰的方法来进一步提高电荷密度(配基修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法，CN103601791A，2014)。而多孔的琼脂糖凝胶介质虽然可以达到很高的电荷密度(1200μmol/g)，但是介质与同电荷蛋白质分子间的静电排斥作用导致蛋白质分子无法进入孔道内，因而只有介质的外表面才能发挥作用(Ion-exehange resins facilitate like-charged protein refolding:Effects of porous solid phase properties.Journal of Chromatography A,2012,1225,168-173)。而纳米粒子由于比表面积大，可修饰电荷密度高，在辅助同电荷蛋白质复性中具有较大优势(Enhanced Protein Adsorption and Facilitated Refolding of Like-Charged Protein with Highly Charged Silica Nanoparticles Fabricated by Sequential Double Modifications.Langmuir,2015,31,655–658)。近来申请人基于同电荷介质辅助复性的方法，建立了一种亚氨基二乙酸(IDA)修饰的琼脂糖凝胶介质IDA-Sepharose FF辅助同电荷的绿色荧光蛋白包涵体的复性与集成纯化的方法(Integrative refolding and purification of histidine-tagged protein by like-charge facilitated refolding and metal-chelate affinity adsorption.Journal of Chromatography A,1344,59–65)。该方法集成了同电荷介质辅助复性和金属螯合纯化技术，同时实现了目标蛋白质的复性和分离纯化。但是受到介质表面IDA修饰方法的限制，介质表面的电荷密度较低(约为108μmol/g)，因此对于较高浓度的包涵体辅助复性的效果并不理想。

发明内容