[发明专利]一种金属螯合纳米介质及制备方法和应用于强化包涵体蛋白复性与集成纯化的方法

权利要求书

1.一种金属螯合纳米介质；其特征是结构式为：

在平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子(SNPs)表面接枝亚氨基二乙酸(IDA)与甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的连接聚合物P(GMA-IDA)；金属螯合纳米介质的电荷密度为2520-5680μmol/g。

2.权利要求1的金属螯合纳米介质制备方法；其特征是步骤如下：

1)合成GMA与IDA的连接产物GMA-IDA；

2)在平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子表面固定引发剂2-溴代异丁酰溴(BIBB)，得到固定BIBB的二氧化硅纳米粒子SNPs-Br；

3)将步骤2)中的固定BIBB的二氧化硅纳米粒子SNPs-Br加入到N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与水的混合液体中，配成浓度为0.1-0.2g/mL的悬浮液，DMF与水的体积比为1:2；

4)在步骤3)的悬浮液中加入GMA-IDA单体、CuBr催化剂、2,2′-联吡啶(Bpy)配体和CuBr₂惰性剂；GMA-IDA的浓度为0.2-1.0mol/L，溶液以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与水的混合液体计算，各组分的摩尔浓度比为GMA-IDA：CuBr:CuBr₂:Bpy＝100:1:0.2:2，聚合反应1-2h，制备得到金属螯合纳米介质SNPs-P(GMA-IDA)。

3.权利要求1的金属螯合纳米介质用于强化包涵体蛋白复性与集成纯化的方法，其步骤如下：

1)将金属螯合纳米介质加入到同电荷包涵体蛋白质的复性缓冲液中，然后加入变性溶解的包涵体蛋白进行复性；

2)复性完成后，体系中加入镍离子，对目标蛋白进行特异性吸附；

3)吸附完成后，离心移除上清液，用洗涤缓冲液洗涤纳米介质；

4)将纳米介质加入到洗脱缓冲液中进行目标蛋白的洗脱，洗脱完成后，离心收集洗脱液，获得纯化的目标蛋白。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是所述的复性缓冲液为：20-100mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)及0-2.0mol/L尿素的混合溶液；用HCl调pH至7.5-9.0。

5.如权利要求3所述的方法，其特征是洗涤缓冲液为：50-100mmol/L Tris,10-50mmol/L咪唑,0.1-0.5mol/L NaCl，0.5-1mol/L尿素；用HCl调pH至7.5-8.5。

6.如权利要求3所述的方法，其特征是洗脱缓冲液为：50-100mmol/L Tris,0.5-1.0mol/L咪唑,0.5-1mol/L尿素；用HCl调pH至7.5-8.5。

7.如权利要求3所述的方法，其特征是所述步骤1)方法是：将金属螯合纳米介质加入到复性缓冲液中，使最终复性体系中纳米介质的浓度为16-64mg/mL；然后置于温度为20-37℃的空气振荡器中震荡预平衡直至温度恒定；加入待复性的包涵体蛋白质溶液，使得复性体系中蛋白质浓度为0.2-0.8mg/mL；混合均匀后，置于空气振荡器中，在转速为50-170rpm条件下复性，复性温度与此前复性缓冲液预平衡的温度相同。

8.如权利要求3所述的方法，其特征是所述步骤2)方法是：复性完成后的体系中加入硫酸镍水溶液，镍离子浓度为0.25-0.45μmol/mg，混合均匀后，置于空气振荡器中，在转速为100-170rpm条件下进行目标蛋白的吸附，吸附温度为20-37℃，吸附时间为20-30min。

9.如权利要求3所述的方法，其特征是所述步骤3)方法是：将吸附完成后的混合体系在4℃，8000-10000rpm条件下离心，移除上清液，将纳米介质用洗涤缓冲液在4℃，8000-10000rpm条件下离心洗涤3-5次，每次洗涤所用的洗涤缓冲液的体积为纳米介质沉降体积的10-20倍。

10.如权利要求3所述的方法，其特征是所述步骤4)方法是：将纳米介质加入到洗脱缓冲液中混合均匀，置于空气振荡器中，在转速为100-170rpm条件下进行洗脱，洗脱缓冲液的体积为纳米介质沉降体积的5-10倍，洗脱温度为20-37℃，洗脱时间为15-30min；洗脱完成后的混合体系在4℃,8000-10000rpm条件下离心，收集上清液。