[发明专利]CsRIP1基因及其表达和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及基因的合成、重组质粒构建、获得重组蛋白的方法。

背景技术

植物核糖体失活蛋白(RIPs)是一种rRNAN-糖苷酶，作用于真核生物核糖体大亚基28SrRNA上的一个高度保守的茎环结构，切除其上的一个特定的腺嘌呤残基，能够抑制延伸因子EF-2与核糖体的结合，从而抑制蛋白质的生物合成。

RIPs分为2种:Ⅰ型RIPs为单链结构，具有rRNAN-糖苷酶活性；Ⅱ型RIPs为一异二聚体，由1条相当于Ⅰ型RIP的A链和1条具有凝集素性质的B链通过1个二硫键连接而成，这2条多肽链均来自一个前体蛋白。

越来越多的研究表明，RIPs在植物应答各种环境胁迫中发挥重要作用，是植物防御体系的组成部分。本领域技术人员早期从茶树叶片中分离出一种受假眼小绿叶蝉取食诱导的Ⅱ型核糖体失活蛋白基因的cDNA片段，命名为Cs-Ev2(GenBank:GH618807)，但尚缺少对茶树Ⅱ型核糖体失活蛋白基因的深入研究。

发明内容

在对Cs-Ev2的深入研究过程中，申请人基于RACE技术获得了该基因的全长cDNA(CsRIP1基因)，并深入研究了该基因的扩增、表达和重组蛋白的生产。申请人进行的实验证实，本发明所得基因表达的重组蛋白对体外蛋白质的合成具有显著的抑制作用。

具体地说，本发明是通过如下技术方案实现的：

CsRIP1基因，具有序列表SEQIDNO:1所示的碱基序列，并表达具有序列表SEQIDNO:2所示氨基酸序列的重组蛋白。

上述重组蛋白的生产是通过重组质粒实现的，用于表达上述重组蛋白的重组质粒是通过如下方法构建的：

1)以CsRIP-F1、CsRIP-R1作为上下游引物，对CsRIP1基因进行PCR扩增；

2)步骤1)所得PCR产物用SacI、XbaI进行双酶切处理，pCzn1质粒用SacI、XbaI进行双酶切处理；

3)取双酶切后的CsRIP1基因扩增片段和双酶切后的pCzn1质粒，在T4DNA连接酶作用下获得pCzn1-A表达载体；4)将所得表达载体加入到感受态细菌中，在含有Amp的LB平板中倒置培养过夜，完成重组质粒构建。

在上述构建过程中，PCR扩增过程为常规操作，采用已有PCR仪器即可实现。

通过上述过程所得重组质粒可用于重组蛋白的表达，具体包括如下步骤：

1)上述所得转化菌株种于含Amp的LB培养液的试管中振摇过夜，培养至菌体OD600为0.6-0.8；

2)向培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，诱导重组蛋白表达。

进一步的，上述表达方法还包括对重组蛋白表达产物进行SDS-PAGE分析的步骤。

进一步的，上述表达方法还包括对重组蛋白表达产物通过Ni柱亲和纯化的步骤。

在上述基础上，本发明还公开了所述重组蛋白在抑制体外蛋白合成中的应用，该应用的具体实现是将重组蛋白加入到蛋白质的体外翻译系统中。

上述所称的蛋白质的体外翻译系统指的是需要抑制的目标蛋白的合成环境。

附图说明

图1为重组蛋白产物的10％SDS-PAGE图；

图2为纯化后的重组蛋白产物的10％SDS-PAGE图。

具体实施方式

在下述实施过程中，所用到的仪器和试剂说明如下：

pCzn1质粒(巴菲尔生物保存)、DH5α菌株(实验室保存)、ArcticExpress^TM菌株(Stratagene)、ProteinMarker(钟鼎生物)、IPTG、Acr、Bis、Tris(Sigma公司)、SDS(Amresco公司)、TEMED(BIO-RAD公司)、Tyrptone、YeastExtract(OXOID公司)、PCR反应管(Fisher公司)、0.22μm无菌滤器和透析袋(Millipore公司)、Ni2+IDA亲和层析胶(Novagen公司)、Agarose(上海基因公司)、DNA胶纯化试剂盒(zoonbio公司DR02-50T)、质粒小提试剂盒(zoonbio公司PD02-50T)；