[发明专利]一种尿嘧啶DNA糖苷酶、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种尿嘧啶DNA糖苷酶、制备方法及其应用。

背景技术

核酸体外扩增技术作为分子生物学和基因工程技术的基石，极大的促进了现在生命科学研究的发展。PCR作为一种最为常见的高效核酸扩增技术，其出现使得体外快速制备特定DNA分子成为可能，目前广泛应用于各种核酸扩增与检测领域，极大地促进了核酸诊断技术、现代基因工程、重组蛋白质工程的发展。为了进一步改善PCR性能，目前开发了多种新型PCR扩增技术。其中PCR反应体系优化，例如通过加入二甲基亚砜(DMSO)、优化镁离子浓度等，能够在一定程度上改善PCR性能，但也存在通用性、重复性差等问题，特别是更换目的基因片段后，通常需要重新优化这些PCR反应条件。另外，热启动DNA聚合酶通过抑制常温下的酶活性，减弱非特异性扩增产物和引物二聚体等副产物，增加目的DNA扩增产量。

在PCR过程中，高温会使4种脱氧核苷三磷酸中的脱氧胞嘧啶核苷三磷酸(dCTP)水解脱氨，生成脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)，其被DNA聚合酶掺入新合成的DNA分子中后以尿嘧啶碱基形式存在，尿嘧啶碱基严重抑制B型DNA聚合酶活性，最终降低DNA有效扩增长度和扩增产量。鉴于各种高忠实性的B型DNA聚合酶在PCR中广泛使用，因此必须解决这一问题，从而提高B性DNA聚合酶的扩增性能。

发明内容

为了克服B型DNA聚合酶活性受尿嘧啶碱基严重抑制的问题，本发明的目的在于提供一种尿嘧啶DNA糖苷酶、制备方法及其应用；本发明的尿嘧啶DNA糖苷酶使其广泛应用于各种B型DNA聚合酶的PCR扩增实例中。该PCR扩增技术具有通用性广、综合性能优良等特点；不仅能显著提高多种商品化DNA聚合酶的PCR产量，还可以增加PCR扩增片段有效扩增长度。

本发明对各种B型DNA聚合酶的PCR扩增技术的改善原理在于：尿嘧啶DNA糖苷酶能将DNA分子中的尿嘧啶碱基从脱氧核糖上水解切除，从而消除DNA中尿嘧啶对DNA聚合酶的抑制作用，提高PCR产量和DNA有效扩增长度。

本发明的技术方案具体如下。本发明提供一种尿嘧啶DNA糖苷酶，其为嗜热微生物的尿嘧啶DNA糖苷酶；所述嗜热微生物为火球菌(Pyrococcusfuriosus)或敏捷气热菌(Aeropyrumpernix)；其中：火球菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；敏捷气热菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。

本发明还提供一种编码上述尿嘧啶DNA糖苷酶的基因，编码火球菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的基因如SEQIDNO:1所示；编码敏捷气热菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的基因如SEQIDNO:2所示。

本发明进一步提供一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，具体步骤如下：

(1)构建尿嘧啶DNA糖苷酶的重组表达质粒

基于嗜热微生物编码的尿嘧啶DNA糖苷酶基因序列，设计引物，扩增基因，并将基因克隆到原核表达载体pET28，构建尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒；

(2)重组表达尿嘧啶DNA糖苷酶

将构建的尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行菌尿嘧啶DNA糖苷酶诱导表达；

(3)亲和纯化表达的尿嘧啶DNA糖苷酶

离心收集诱导表达尿嘧啶DNA糖苷酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，加热失活大肠杆菌自身蛋白，离心收集含有尿嘧啶DNA糖苷酶的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中分别纯化尿嘧啶DNA糖苷酶；

(4)检测尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和热稳定性。

将纯化后尿嘧啶DNA糖苷酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出95℃下特异性切除尿嘧啶碱基的酶活性半衰期不低于30分钟的尿嘧啶DNA糖苷酶。

上述步骤(1)中，所述嗜热微生物为火球菌或敏捷气热菌。

上述步骤(2)中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株培养至OD₆₀₀＝0.4-1.0，再加入0.5mM诱导剂IPTG在37℃温度下培养3小时或22℃温度下培养12小时进行诱导表达。

上述步骤(3)中，所述非变性蛋白裂解液的组成如下：20mMpH值为8.0的Tris-HCl,300mMNaCl，0.5mMDTT，10vol％甘油。