[发明专利]一种尿嘧啶DNA糖苷酶、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于，其为嗜热微生物的尿嘧啶DNA糖苷酶；所述嗜热微生物为火球菌或敏捷气热菌；其中：火球菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；敏捷气热菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。

2.一种编码权利要求1所述尿嘧啶DNA糖苷酶的基因，其特征在于，编码火球菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的基因如SEQIDNO:1所示。

3.一种编码权利要求1所述尿嘧啶DNA糖苷酶的基因，其特征在于，编码敏捷气热菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的基因如SEQIDNO:2所示。

4.一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建尿嘧啶DNA糖苷酶的重组表达质粒

基于嗜热微生物编码的尿嘧啶DNA糖苷酶基因序列，设计引物，扩增基因，并将基因克隆到原核表达载体pET28，构建尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒；

(2)重组表达尿嘧啶DNA糖苷酶

将构建的尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行菌尿嘧啶DNA糖苷酶诱导表达；

(3)亲和纯化表达的尿嘧啶DNA糖苷酶

离心收集诱导表达尿嘧啶DNA糖苷酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，加热失活大肠杆菌自身蛋白，离心收集含有尿嘧啶DNA糖苷酶的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中分别纯化尿嘧啶DNA糖苷酶；

(4)检测尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和热稳定性。

将纯化后尿嘧啶DNA糖苷酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出95℃下特异性切除尿嘧啶碱基的酶活性半衰期不低于30分钟的尿嘧啶DNA糖苷酶。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述嗜热微生物为火球菌或敏捷气热菌。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株培养至OD₆₀₀＝0.4-1.0，再加入0.5mmol/L诱导剂IPTG在37℃温度下培养3小时或22℃温度下培养12小时进行诱导表达。

7.一种权利要求1所述的尿嘧啶DNA糖苷酶于B型DNA聚合酶的PCR扩增技术中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述B型DNA聚合酶为PfuDNA聚合酶、KODDNA聚合酶或VentDNA聚合酶。