[发明专利]一种植物线粒体DNA的快速提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种植物线粒体DNA的快速提取方法。

背景技术

线粒体是植物细胞的重要细胞器，它是自身具有一定遗传功能结构的基因组，能够自我复制，可编码一些呼吸代谢过程中的重要酶成分，为细胞生理活动提供能量。线粒体作为细胞能量代谢和物质转化的中枢，在细胞合成、物质转运及信息传递中起着重要作用。另外，对许多高等植物细胞质雄性不育研究表明，线粒体与细胞质雄性不育有密切关系，是雄性不育因子的重要载体。研究线粒体DNA(mtDNA)的结构与功能，对作物改良，探索细胞器的起源和进化，特别在植物细胞质雄性不育的研究、不同雄性不育的细胞质分类上有重要的意义。

提取高质量的线粒体DNA是对线粒体遗传系统进行深入研究的基本前提。植物线粒体DNA与核DNA相比，在细胞内含量甚微，提取过程中极易被核及叶绿体DNA污染。另外，植物mtDNA大多数为环状分子，每个线粒体中DNA分子数从几拷贝到几十拷贝不等，且不同物种mtDNA分子大小差别很大，从几十kb到几千kb不等，所对应的mtDNA提取方法也不同。总体来看，植物mtDNA提取方法，主要有密度梯度离心和差速离心等方法。密度梯度离心得到的线粒体DNA纯度高，但操作复杂、耗时、对材料的需求量大、产率低；普通差速离心操作简单，但所提取的mtDNA纯度低，易降解，核DNA、RNA和蛋白质等杂质污染严重。这些不利因素的制约导致现有的线粒体提取方法不能满足后续研究工作的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物线粒体DNA的快速提取方法，该方法能高效、简单、快速得获得高质量的线粒体DNA，可以满足PCR扩增、定量和定性分析、测序等分子生物学实验的要求。

本发明的技术方案是：一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，具体包括下述步骤：

(1)溶液配制

BufferA：0.4M蔗糖，5mMEDTA(乙二胺四乙酸)，50mMTris-HCl，10mM三甲基甘氨酸，8mM半胱氨酸，0.1％BSA(牛血清白蛋白)和1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，pH7.8；

BufferB：0.4M蔗糖，1mMEDTA，10mMTris-HCl，0.1％BSA，pH7.2；

溶液W1：1％葡萄糖，50mMEDTA，25mMTris-HCl，pH8.0；

溶液W2：0.2mMNaOH，1％SDS(十二烷基硫酸钠)；

溶液W3：5mol/LKAC(醋酸钾)，pH4.8；

漂洗液WT：70％酒精；

洗脱缓冲液TB：10mMTris-HCl，1mMEDTA，PH＝8.0；

备注：其中，70％酒精的百分数为体积比，其余百分数均为质量体积比w/v(即g/ml)。

(2)预处理

取植物新鲜幼嫩组织于4℃环境中暗处理24h，在预冷(预冷至2-4℃)的蒸馏水中清洗材料[若需消毒，在终浓度为0.7％(w/v)的次氯酸钠稀释液中浸泡5min]；材料预处理后立即进行提取，以避免细胞膨胀压力及获得最大量的线粒体，下述步骤均需在2-4℃下进行；

(3)研磨

在预冷的研钵中加入BufferA，再加入预处理的材料进行研磨；研磨后通过4-8层的医用纱布过滤，收集过滤液并保持其pH在7.0以上(若不足，用NaOH调整)；

(4)分离线粒体

将收集液于4℃，1000g离心5±1min，收集上清；4℃，12000g离心20±2min，弃掉上清；加入BufferB，用软毛笔重悬绿色沉淀颗粒；然后4℃，1000g离心5±1min，收集上清；加入DNaseⅠ，放置1-2h；加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)，混匀后静止10±2min，终止反应；4℃，12000g离心20±2min，弃掉上清；

(5)提取线粒体DNA

向沉淀中加入溶液W1悬浮沉淀；然后加入溶液W2，温和颠倒6-8次，再加入溶液W3，温和颠倒离心管，充分混匀溶液；离心10±2min，吸取上清放入吸附柱(带有核酸硅胶膜的硅胶膜离心吸附柱)中，再离心，倒掉废液；向吸附柱中先后2次加入漂洗液WT，离心漂洗吸附柱；最后将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，离心2-3min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。

进一步地，所述步骤(3)所使用的BufferA，若为非绿色组织，则比例为2ml/g；若为绿色组织，4ml/g。