[发明专利]一种植物线粒体DNA的快速提取方法

权利要求书

1.一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，具体包括下述步骤：

(1)溶液配制

BufferA：0.4M蔗糖，5mMEDTA，50mMTris-HCl，10mM三甲基甘氨酸，8mM半胱氨酸，0.1％BSA和1％PVP，pH7.8；

BufferB：0.4M蔗糖，1mMEDTA，10mMTris-HCl，0.1％BSA，pH7.2；

溶液W1：1％葡萄糖，50mMEDTA，25mMTris-HCl，pH8.0；

溶液W2：0.2mMNaOH，1％十二烷基硫酸钠；

溶液W3：5mol/L醋酸钾，pH4.8；

漂洗液WT：70％酒精；

洗脱缓冲液TB：10mMTris-HCl，1mMEDTA，PH＝8.0；

其中，70％酒精的百分数为体积比，其余百分数均为质量体积比；

(2)预处理

取植物新鲜幼嫩组织于4℃环境中暗处理24h，然后在预冷至2-4℃的蒸馏水中清洗材料或者在终浓度为0.7％(w/v)的次氯酸钠液中浸泡进行消毒；

(3)研磨

在预冷的研钵中加入BufferA，再加入预处理的材料进行研磨；研磨后通过4-8层的医用纱布过滤，收集过滤液并保持其pH在7.0以上；

(4)分离线粒体

将收集的过滤液于4℃，1000g离心5±1min，收集上清；4℃，12000g离心20±2min，弃掉上清；加入BufferB，用软毛笔重悬绿色沉淀颗粒；然后4℃，1000g离心5±1min，收集上清；加入DNaseⅠ，放置1-2h；再加入0.5mol/LEDTA，混匀后静止10±2min，终止反应；4℃，12000g离心20±2min，弃掉上清；

(5)提取线粒体DNA

向沉淀中加入溶液W1悬浮沉淀；然后加入溶液W2，温和颠倒6-8次，再加入溶液W3，温和颠倒离心管，充分混匀溶液；离心10±2min，吸取上清放入带有核酸硅胶膜的硅胶膜离心吸附柱中，再离心，倒掉废液；向吸附柱中先后2次加入漂洗液WT，离心漂洗吸附柱；最后将吸附柱放入一个干净的离心管中，向核酸硅胶膜中间部位滴加洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，离心2-3min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存；

上述步骤(2)-(4)均需要在2-4℃下进行操作。

2.如权利要求1所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，采用的材料为非绿色组织，BufferA用量为2ml/g，以材料的总质量计。

3.如权利要求1所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，采用的材料为绿色组织，BufferA用量为4ml/g，以材料的总质量计。

4.如权利要求1所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，所述步骤(4)的BufferB用量为40ml/g，以材料的总质量计。

5.如权利要求4所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，先加入BufferB5-10ml/g，用软毛笔重悬绿色沉淀颗粒；将重悬液转移到一个新的离心管中，再加入BufferB至40ml/g。

6.如权利要求1所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，所述步骤(5)中离心的离心速度均为10000-15000g。

7.如权利要求6所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，所述步骤(5)中离心的离心速度均为12000g。

8.如权利要求1所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，所述步骤(5)吸附柱放入一个干净的离心管中滴加洗脱缓冲液TB前，再12000g离心2min。

9.如权利要求1-8中任意一项所述的一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，所述步骤(5)每1g材料，采用2ml溶液W1悬浮后，加入250μl溶液W2和350μl溶液W3。