[发明专利]一种DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种DC‑CIK细胞培养试剂及其培养方法。该培养试剂包括DC细胞培养试剂、CIK细胞培养试剂和共培养试剂；DC细胞培养试剂包括第一DC细胞培养试剂和第二DC细胞培养试剂；第一DC细胞培养试剂包括GM‑SCF和IL‑4；第二DC细胞培养试剂包括GM‑SCF、IL‑4、TNF‑α和MDC。通过本发明提供的培养方法得到的DC细胞和DC‑CIK细胞量大，DC‑CIK有效细胞CD3+CD56+比例高，对肿瘤的杀伤能力更强。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种DC-CIK细胞培养试剂及其培养方法。

背景技术

肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止生长，他的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官，这一点在恶性肿瘤尤其明显。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、坏死、溃疡等，并常有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患者死亡。

恶性肿瘤是严重威胁人们生命健康的第一病害，在继切除手术、放疗、化疗之后，肿瘤免疫细胞治疗是临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，它是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。在现有的免疫细胞治疗中有相继出现LAK细胞疗法、TIL细胞疗法、DC细胞疗法、CIK细胞疗法和DC-CIK联合疗法，在肿瘤治疗中发挥举足轻重的作用。

树突状细胞(Dendritic cells,DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。

CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。

DC和CIk共培养可以同时促进CIK细胞和DC细胞的增殖和免疫功能。化疗后应用DC-CIK细胞可有效抑制肿瘤细胞生长，甚至使肿瘤完全消失；而且DC-CIK细胞的抗肿瘤效应对集体免疫系统功能不产生危害，在当前对肿瘤特异性抗原了解相对较少的情况下，应用DC-CIK细胞作为肿瘤放化疗和手术后的辅助治疗有重要的临床意义。

目前，DC和CIk共培养方法为：1、外周血分离单个核细胞；2、无血清培养基培养1-3h，贴壁细胞添加自体血清致敏培养DC细胞，第6-7天，添加肿瘤坏死因子培养；未贴壁细胞按常规CIK细胞培养方案培养；3、DC细胞和CIK细胞混合培养5-8天，收获细胞。专利公开号为CN 103981144A、CN 103255105A、CN 104357394A、CN 102978161A等专利也均公开了DC-CIK细胞共培养方法。

然而，上述培养方法存在一定的缺陷：DC细胞培养过程中，初始贴壁细胞易向巨噬细胞分化，收获的DC细胞很少；肿瘤病人血清致敏DC细胞，抗原致敏性弱，DC细胞抗原递呈能力低，获得的DC-CIK细胞杀伤活性不高。因此，急需提供一种DC细胞收获量大、对肿瘤细胞杀伤能力强的DC-CIK细胞共培养方法。

发明内容