[发明专利]HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因分子检测领域，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测方法，尤其涉及一种HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

遗传性非息肉性结直肠癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer，HNPCC)是消化系最常见的遗传性肿瘤，外显率达80％-90％，其发病与人类的错配修复基因(mismatchrepairgene，MMR)功能缺陷密切相关。尽管HNPCC有明显家族史，但确诊HNPCC患者或家系赖以检测出胚系MMR基因病理性突变。迄今，已经定位并克隆的人类MMR基因有7个，其中至少5个(MLH1、MSH2、MSH6、PMS1和PMS2)与HNPCC有关，但与HNPCC的发病关系最为密切的是MLH1和MSH2基因，遗传连锁分析和遗传学研究显示，约90％的HNPCC有MLH1和MSH2基因的胚系异常。

结直肠癌发病率日渐增高，而治疗效果不甚理想，总的10年生存率徘徊在50％左右。如何提高结直肠癌的治愈率，关键在于大肠癌的早期诊断与早期治疗。随着分子生物学技术的发展，人们对肿瘤病因及发病机制的认识越来越深入。从病因机制出发干预、阻断肿瘤的发生发展，是肿瘤防治的发展方向，这也成为我国结直肠癌防治研究面临的挑战与机遇。就发病机制而言，原发性结直肠癌包括散发性和遗传性两大类，后者即包括HNPCC。由于HNPCC和散发性结直肠癌的发病机制不同，两者在治疗方案的选择上、随访方案的制定上都不尽相同，将两者区分开来不仅具有实际的临床意义，而且还有利于遗传学咨询。

大量研究证实，HNPCC的发生与错配修复基因的功能缺陷有关，并肯定至少与5个错配修复基因有关(MLH1、MSH2、PMS1、PMS2、MSH6)。

错配修复基因是生物进化过程中的保守基因，在DNA的复制过程中起着修复DNA碱基错配的功能，使得DNA在遗传信息流动过程中保持着忠实性。1993年三个研究小组同时发现几乎所有的HNPCC都出现微卫星重复序列长度的改变，一些生物遗传学家立刻意识到这种突变子表型是错配修复基因功能缺陷引起的，对酵母和细菌的研究发现，错配修复系统功能缺陷时，会导致相似的基因组不稳定性^[11]。为了将HNPCC和散发性结直肠癌区分开来，人们采用了很多手段，例如不同的临床筛选标准、微卫星不稳定性检测、错配修复蛋白表达的免疫组织化学检测、基因测序等等，然而，迄今还没有一种理想的手段和策略^[LynchPM.ThehMSH2andhMLH1genesinhereditarynonpolyposiscolorectalcancer[J].SurgOncolClinNAm，2009，18(4):611-24^]。

从相关的文献资料可以看出，人们多侧重突变、蛋白表达和微卫星不稳定性三方面的研究【LynchPM.ThehMSH2andhMLH1genesinhereditarynonpolyposiscolorectalcancer[J].SurgOncolClinNAm，2009，18(4):611-24.Coolbaugh-MurphyML，XuJP，RamagliLS，etal.MicrosatelliteinstabilityintheperipheralbloodleukocytesofHNPCCpatients.HumMutat，2010，31(3):317-324.】。然而，遗传信息的流动是靠复制、转录和翻译完成的，基因表达就是遗传信息通过mRNA的传递而翻译成专一的蛋白质或酶，从而使细胞的表型得以表现的过程。错配修复基因突变能引起微卫星不稳定性和修复蛋白的表达异常，如果错配修复基因没有突变而在转录水平上出现异常是否会引起错配修复蛋白的表达异常？错配修复基因突变后其相应的mRNA量如何改变？mRNA的定量分析能用于HNPCC家系的筛选吗？经PubMed网上查询尚未见报道。