[发明专利]HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种HNPCC外周血MLH1基因表达的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)设计引物和探针；

该引物的序列为：

MLH1上游引物：5′-GTTCTCCGGGAGATGTTGCATA-3′，如SEQIDNO.1所示或其互补链；

MLH1下游引物：5′-TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTTG-3′，如SEQIDNO.2所示或其互补链；

该探针的序列为：

MLH1TaqMan探针：F-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-P，如SEQIDNO.3所示或其互补链；

(2)提取HNPCC家系外周血总RNA，逆转录合成cDNA第一链；

(3)采用步骤(1)设计的MLH1引物和探针进行实时荧光定量PCR检测，以保守基因HBA2作为对照；

(4)将每一标本所得MLH1基因拷贝数与其相对应的HBA2基因拷贝数相除来校正不同标本之间RNA的质量和逆转录效率的差异，得出MLH1基因相对表达量；在符合AmsterdamⅡ标准家系间，比较健康人与患者之间外周血MLH1基因表达水平差异。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取HNPCC家系外周血总RNA为收集符合AmsterdamⅡ标准家系19个共46个家系成员的外周血标本，提取各成员的总RNA。

3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取HNPCC家系外周血总RNA的具体步骤为：抽取HNPCC患者或家庭成员外周血，放入离心管中离心；弃去上层血浆，混匀中层有核细胞和下层红细胞；加入低渗液，充分混匀后常温下放置45～60min；离心，弃去上层溶解的红细胞，用低渗液洗去溶解的红细胞；用手指弹开管底沉淀的有核细胞后，加入Trizol，充分混匀，4℃放置10min；加入氯仿，充分混匀，4℃放置5min；低温离心机离心10min；汲取上清液于另一无菌管中，加入等量的异丙醇，混匀后4℃放置10min；4℃离心15min；RNA沉淀于管底，弃去上清液，加入80％冷乙醇轻洗2次，弃去乙醇，倒扣离心管于洁净处，待RNA干燥后加入DEPC水溶解，置-70℃冰箱中备用。

4.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述逆转录合成cDNA第一链具体为利用耐热性逆转录酶和随机引物，逆转录各成员的RNA。

5.如权利要求1所述的R检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR检测的反应体系为20μL，包括Master混合液10μL，步骤(1)设计的MLH1上下游引物各1μL，MLH1TaqMan探针1μL，cDNA模板2μL，去离子水5μL。

6.如权利要求1或5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR检测的反应条件为：预变性94℃5min；然后94℃45s，58℃45s，72℃45s，共44次循环。

7.一种用于检测HNPCC外周血MLH1基因表达的引物，其特征在于，其序列为：

MLH1上游引物：5′-GTTCTCCGGGAGATGTTGCATA-3′，如SEQIDNO.1所示或其互补链；

MLH1下游引物：5′-TGGTGGTGTTGAGAAGGTATAACTTTG-3′，如SEQIDNO.2所示或其互补链。

8.一种用于检测HNPCC外周血MLH1基因表达的探针，其特征在于，其序列为：MLH1TaqMan探针：F-CCTCAGTGGGCCTTGGCACAGC-P，如SEQIDNO.3所示或其互补链。