[发明专利]一种大丽花脱毒苗的获取方法

权利要求书

1.一种大丽花脱毒苗的获取方法，其特征在于：该方法步骤如下：

1）采集大丽花嫩叶，脱分化产生愈伤组织；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽、不定芽生根培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即大丽花脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的大丽花脱毒种苗。

2.根据权利要求1所述的大丽花脱毒苗的获取方法，其特征在于：该方法的详细步骤如下：

1）采集大丽花嫩叶，脱分化产生愈伤组织：

采集生长至现蕾期的健康无病的大丽花的嫩叶，自来水洗净，流水冲洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞内加数滴吐温-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒搅动，用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干，用孔直径5mm的打孔器打孔，将打下的叶片接种到愈伤诱导培养基上25-27℃条件下暗培养，10-15天后产生淡黄绿色疏松的愈伤组织；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽、不定芽生根培养成健壮的组培苗：

将生长至大米粒大小、带有少量外植体的愈伤组织转移到培养箱中热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上25-27℃条件下光培养，20-30天后愈伤组织分化出不定芽，将再生出来的高度1cm以上的芽转接至生根培养基培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织：

待组培苗生长至5cm-8cm，剥取0.4-0.6cm大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈伤培养基上，在25-27℃条件下暗培养30-45天，诱导出愈伤组织；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗：

再次将茎尖愈伤组织进行热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，25-27℃条件下光培养20-25天后诱导出不定芽，然后转接入生根培养基，40-50天后可得到大丽花幼苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即大丽花脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的大丽花脱毒种苗：

随机抽取8-10只完成了步骤4）的的大丽花叶片，进行RT-PCR反转录病毒检测，若检测合格即大丽花脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的大丽花脱毒种苗。

3.根据权利要求1或2所述的大丽花脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤1）中用于诱导大丽花叶片产生愈伤组织的愈伤诱导培养基配方为：MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+3%蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8。

4.根据权利要求1或2所述的大丽花脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤2）中将将愈伤组织继续诱导出不定芽的不定芽诱导培养基配方为：MS+2.5mg/L6-BA+0.08NAA+3%蔗糖+6.5g/L植物凝胶，pH为5.8；所述的将愈伤组织继续诱导出不定芽、不定芽生根培养的光照条件均为：光照强度为1500-2000Lux，光周期为14h光/10h暗。

5.根据权利要求1或2所述的大丽花脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤2）和步骤4）中热处理方法为：在38℃-42℃高温处理6h-8h、然后26℃-28℃低温处理10h-12h交替进行2-3循环。

6.根据权利要求1或2所述的大丽花脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤3）中用于诱导茎尖产生愈伤组织的培养基配方为：MS+4.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LKT+3%蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8。

7.根据权利要求1或2所述的大丽花脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤4）中将愈伤组织诱导出不定芽的不定芽诱导培养基配方为：MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+3%蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8；生根培养基配方为：1/2MS+0.15mg/LNAA+1.5%蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8。

8.根据权利要求1或2所述的大丽花脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤4）中将茎尖愈伤组织继续诱导出不定芽、不定芽生根培养的光照条件均为：光照强度为1500-2000Lux，光周期为12h光/12h暗。

9.根据权利要求1或2所述的大丽花脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤5）病毒检测的病毒种类为大丽花叶病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒。